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微生物的染色技术及显微镜观察(二)

2020-07-27 | 来源:
二、革兰氏染色法1目的1.1了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。1.2学习掌握革兰氏染色技术,巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。2原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的,革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是:先用初染剂结晶紫进行初染,再用碘液媒染,然后

二、革兰氏染色法   1  目的   1.1 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。  1.2 学习掌握革兰氏染色技术,巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。

2  原理   革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain   Gram氏创立的,革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。  革兰氏染色法的基本步骤是:先用初染剂结晶紫进行初染,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脱色,最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌;如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色),该菌属于革兰氏阴性菌。

  革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上,当用结晶紫初染后,像简单染色法一样,所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂,它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物,从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时,两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,壁厚、类脂质含量低,用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高,所以当脱色处理时,类脂质被乙醇(或丙酮)溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。

  3  材料   3.1  菌种   大肠杆菌(Escherichia  coli)约24h营养琼脂斜面菌种一支,枯草芽孢杆菌(Bacillus   subtilis)约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。   3.2  染色剂   结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。  3.3  仪器或其他用具   显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。   4  流程   涂片→干燥→固定→染色(初染→媒染→脱色→复染)→镜检。   5  步骤   5.1  涂片   5.1.1  常规涂片法   取一洁净的载玻片,用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号,并在两端各滴一小滴蒸馏水,以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片,干燥、固定。玻片要洁净无油,否则菌液涂不开。

  5.2  初染   滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上,染色1~2min ,倾去染色液,细水冲洗至洗出液为无色,将载玻片上水甩净。   5.3  媒染  用卢戈氏碘液媒染约l min ,水洗。   5.4  脱色   用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗,终止脱色,将载玻片上水甩净。   革兰氏染色结果是否正确,乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足,阴性菌被误染成阳性菌,脱色过度,阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20~30s。   5.5  复染   在涂片上滴加番红液复染约2~3min ,水洗,然后用吸水纸吸干。在染色的过程中,不可使染液干涸。   5.6  镜检   干燥后,用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌(G+),被染成红色的为革兰氏阴性菌(G-)。  5.7  实验结束后处理   清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油,然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹,最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗,凉干后备用。

  三、实验结果   1 根据观察结果,绘出两种细菌的形态图。   2列表简述两株细菌的染色结果(菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。   四、思考题  1 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么?   2 进行革兰氏染色时,为什么特别强调菌龄不能太老,用老龄细菌染色会出现什么问题?   3 革兰氏染色时,初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?   4 不经过复染这一步,能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌?   5 你认为制备细菌染色标本时,应该注意哪些环节?   6 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?   7 如果涂片未经热固定,将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长,又会怎样呢?

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