Figure 4．IR-MPM的光漂白，光毒性和组织穿透性. (a)以75mW能量的760, 880, and 1100 nm 激发波长连续扫描的释放光的下降时测量的DsRed2光漂白。样品被进行250次连续扫描，释放光强度以整个扫描区域的平均像素强度量化，并对首幅图像强度归一化。虚线表明了1100nm处的以释放光强度下降末端点进行归一化的漂白效率(b) 持续激发导致的蛋白凝结。双色HT-1080细胞在高激发能（110mW）和2.8幅/秒帧速下的连续成像。箭头和星号表明了凝结蛋白的聚集。(c)1100nm波长以焦点处117mW的能量强度连续激发期间，真皮切片中的多细胞球体中的HT-1080细胞向外迁移没有削弱。数字表明经过的时间。通过细胞跟踪获得的种群周转率与传统亮视野显微镜下监测的细胞比较。近乎完全重叠的迁移速率回归曲线被展示。用于SHG（d）穿透深度测量的4mm厚自然状态人皮肤切片和用于荧光（e）测量的直径1mm的双色HT-1080细胞球。对于二者，3维的皮肤或者多细胞球，880nm和1100nm以75mW能量的激发，SHG和荧光信号释放被以完全相同的PMT灵敏度检测。(d) and (e) 中的虚线展示了测得的50%的释放光信号强度，以之作为归一化的整个扫描区域的平均像素强度。标尺(c), 150 µm.

IR-MPM 用于深层组织成像

    虽然近红外光与可见光相比，水只能很少的吸收，但是水会增加对大于900nm的激发光的吸收，因此造成了IR-MPM在活的含水丰富组织的生物化学方面应用。考虑到这个因素，使用1100nm激发比880nm激发在人体皮肤纤维蛋白的原位观察方面最大成像深度增加了2倍(Figure 4d). 同理，水性基质中的DsRed2荧光细胞可以在固体多细胞球体结构中2倍深度的层次中检测到(Figure 4c).因此，如预先说的，IR-MPM适用于生物组织的更深层成像。

    因此，在移植的双色HT-1080细胞中，移植入小鼠皮肤8天后，使用1100nm激发对DsRed2信号的检测深度相对于使用880nm激发增加了2倍，可达500um（Figure 5a–c). 淋巴结内CMTMR标记的树突细胞从上皮层使用1100nm激发，成像深度可以达700um(Figure 6a–c).

    对于深层组织的多光子显微成像的另一个严重限制是随成像深度增加，空间分辨率下降。在使用近红外激发的淋巴结中，50um的成像深度时图像质量比表面成像下降了2到5倍。 Figure 5d 表明即使有足够的深层组织信号，细胞边界和亚细胞细节的分辨率也会受到散射性肿瘤组织的强烈影响。但是，我们的测量结果表明，IR-MPM比NIR-MPM显著降低了这种质量下降 (V Andresen, P Friedl, unpublished data).因此，对某些深层的窗口，IR-MPM提供了无与伦比的成像质量。

 Figure 5 活体中表达DsRed2的肿瘤移植物的IR深层双光子组织显微观察。植入小鼠皮肤的人类双色HT1080纤维肉瘤细胞，以75mW能量输入的(a) 880 and (b) 1100 nm激发的3D堆栈。Z轴的步长为5µm。V显示了一个大血管的区域（负对照） (c) 一个作为穿透深度功能的归一化的荧光强度。与皮肤表面下10到50 µm损伤位置相关的强度曲线的初始斜率(d) (b)中虚线展示的与1100nm激发在Z轴穿透深度的增加相伴随的空间分辨率的下降。插图展示的是全景图的细节放大。标尺 100 µm ((a) and (b)), 50 µm (d), and 20 µm ((d), 插图).