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LaVision双光子显微镜-多焦点扫描与光激活蛋白在...(二)

2020-06-29 | 来源:
3.结果Fig.2.含有核输入输出信号的拟南芥转录因子LCL1(分别为NLS,NES).由质粒编码GFP融合蛋白转染的烟草BY-2原生质体。通过单光子共聚焦激光扫描显微镜分析的GFP融合蛋白稳定态定位。(a)GFP-LCL1揭示的核与细胞质间的分区(b)使用核输出抑制剂leptomycinB(LMB)孵育后,由于功能性NLS的存在,GFP-LCL1的稳定态分区剧烈转化为几乎完全分布于核中。(c,d)

3. 结果

Fig. 2.含有核输入输出信号的拟南芥转录因子LCL1 (分别为NLS, NES). 由质粒编码GFP融合蛋白转染的烟草BY-2原生质体。通过单光子共聚焦激光扫描显微镜分析的GFP融合蛋白稳定态定位。(a) GFP-LCL1 揭示的核与细胞质间的分区

 (b) 使用核输出抑制剂leptomycin B (LMB)孵育后,由于功能性NLS的存在,GFP-LCL1的稳定态分区剧烈转化为几乎完全分布于核中。 (c,d) 对照,LMB对单独的GFP没有影响。 (e) GFPLCL1(NESm)中,它的NES的点突变造成的LCL1的核输出活性削弱同样导致了GFP融合蛋白在核内的聚集。(f) 与(e)中同一个原生质体的透射光与GFP荧光成像的叠加标尺为10um (g) 作为对照的 GFP-NLS 在核内的增加。 (h) 同一原生质体的GFP-NLS绿色荧光蛋白和作为转染标记的Pra1-DsRed (At2g38360)红色荧光蛋白的叠加。

Fig. 3. pa-GFP 在一个活原生质体内的自由动态扩散。选出的5幅表达pa-GFP的烟草BY-2原生质体的单光子透射荧光图像。(a)实验开始,未激活 (b) pa-GFP的双光子激活期间 (c–e) 双光子激活后,所示时间点。(a)核内(红虚线)的pa-GFP在双光子激发前平均荧光很难被检测到。使用4个平行焦点(10mW at 800 nm 每焦点)的持续3s的飞秒激光对一个7X8um的区域进行pa-GFP 2光子激发开始 (b) 激发后很短时间内检测到一个强的荧光信号(c–e) pa-GFP从核内向细胞质的扩散被监测,直到两组分间达到平衡。荧光强度标尺显示在每幅图的左边。

Fig. 4.在核内被光激活后,pa-GFP从核内向细胞质扩散的量化分析。在激活前,核内(ROI)平均的1光子荧光强度非常低(平均强度~300).在26s和29s间的时间点,由飞秒激光激活诱导的荧光增强在图上进行了监测。 与光激活前相比,平均荧光强度是之前的大约5倍,伴随着ROI内的荧光降低。在第一个地方,监测到的细胞核内荧光下降是由于激活的pa-GFP向细胞质内的扩散。后来,光漂白变得显著。双指数拟合非常近似地拟合了整个荧光下降过程(红线)。以此方式计算出这个实验中175s的扩算时间常数。

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