系统性能和Ti:Sa与OPO激光的同时使用

    为了同时获取样品Ti：Sa和OPO的激发，一个分光器将Ti：Sa激光分解为泵浦OPO光束和直接成像光束(Figure 1a). 分光比例取决于足够激发所需的光亮，先后依赖于样品特征（光密度，连续性和荧光团吸收截面）和想要的成像深度。在实际应用中，一个90/10的分光比例对于泵浦OPO和直接进行Ti：Sa成像是有用的，可使830nm和1129nm的两束激光分别在其激发焦点处产生大约100mw的能量

Figure 1 活体近红外和红外多光子显微镜的结构及其空间解析 (a) 锁模Ti：Sa激光器产生的光束(775 or 830 nm; 80 MHz;120 fs)被分解为泵浦一个OPO的光束和直接激发样品的光束。OPO允许自动的软件控制的波长调谐以及能量输出稳定性，通过使用一个整合的光谱仪和马达驱动的腔室长度调节和一个马达驱动的腔室末端镜子实现。NIR和IR光束通过独立的光束整形设备，每一个都包括一对交叉的起偏镜(P)来控制激发能，一个望远镜(T)来调节光束直径以适应焦平面后的物镜尺寸，一个啁啾补偿组件(C)补偿由于物镜和媒介光学元件导致的脉冲展宽。使用后者可以将物镜(V Andresen, P Friedl, unpublished data)出口处的脉冲长度从380降低到120fs(Ti:Sa)和从270降低到120fs（OPO）。为获得最大效率，OPO光路中的所有光学元件都进行了镀膜并在波长延展段做了修正。两束光通过一个二色镜(DM; slope at 1020 nm)做了同轴混合，一起通过一对振镜扫描器。发射信号在前向被一个1.4 NA的特殊的聚光器收集，在后向通过一个物镜收集。光谱的分离通过分光镜和每个光电倍增管PMT前的带通滤波器实现。在前向与后向，激光通过遮光滤光片反射。缩写: SL, 扫描镜; TL, 场镜; M, 镜子. (b) IR-MPM侧向和轴向的点扩展函数PSF。一个0.95NA的IR 20 X 物镜和1100nm的激发光波长被用于激发小于分辨率极限的红色荧光聚苯乙烯小球（分子探针）(100 nm). 焦点处能量为15mw，像素驻留时间为240ms，以收集到足够的信号。通过对X，Y,Z的一维高斯拟合和半峰全宽计算PSF的尺寸。最终的PSF代表了视野中不同位置的15个独立小球的平均值。

    IR-MPM的光学分辨率通过测量红色荧光聚苯乙烯小珠的横向和轴向点扩散函数PSF来确定。对于0.95N.A的20 x IR物镜，激发光波长为1100nm时，水作为浸没基质，总计IR-MPM PSF的直径是横向564nm，轴向2240nm。这些值稍微大于理论数字，可能是因为对物镜在长激发波长不完美的修正引起的，也再次确认了先前使用1500nm120fs的脉宽激发的数据。因此，IRMPM适用于提供接近光学衍射极限的图像。

红色染料和荧光蛋白的双光子激发和释放光谱

    在MPM中，荧光分子或蛋白被同时吸收的大于2个光子同时激发，它们共同为激发提供能量。这意味着最优的光学激发波长大约是相应单光子激发的两倍。因此，对红色荧光团的激发效率显著高于1100nm。