第七章　电子显微镜免疫细胞化学技术

第一节　电子显微镜免疫细胞化学技术概述

免疫细胞化学技术为在细胞水平上研究免疫反应做出了贡献，但由于光学分辨率的限制，不可能从细胞超微结构水平观察和研究免疫反应。因此，Singer于1959年首先提出用电子密度较高的物质铁蛋白（ferritin）标记抗体的方法，为在细胞超微结构水平研究抗原抗体反应提供了可能。在此基础上，相继发展了杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物技术、蛋白A-铁蛋白标记技术、免疫酶技术及胶体金技术等。电子显微镜免疫细胞化学技术（以下简称免疫电镜技术技术）区别于免疫细胞化学和常规电镜技术主要在以下几方面：

一、组织固定与取材

在这方面的要求是即要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。因此，选用固定剂不宜过强。常用的免疫电镜固定剂有多聚甲醛―戊二醛混合液和过碘酸-赖氨酸―多聚甲醛液（Periodate―Lysine �Paraformaldehyde简称PLP液）。也有采用Bouin氏液、Zamboni氏液或4%多聚甲醛液（其配制法见附录）。国外不少文献推荐应用PLP液于免疫电镜技术，认为该固定液对含糖类丰富的组织固定效果特佳，因为组织抗原绝大多数由蛋白质和糖两部分组成，抗原决定簇位于蛋白部分，有选择性地使糖类固定，就可使抗原性稳定。PLP液中过碘酸能氧化糖类，使其产生醛基，再经赖氨酸作用，使新形成的醛基分子间和分子内相互连接，稳定组织抗原。但赖氨酸价格较贵，不如多聚甲醛戊二醛固定液经济、简便、效果佳。在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。

二、免疫染色

分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。

1．包埋前染色 　即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。如果特异性免疫反应的范围太小，为了准确定位，可作第二次包埋，即第一次包埋时将组织置于两层thermanox塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的组织，以中层较为理想。表层因受机械修整，结构往往保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。在作超薄切片前应先切半薄切片，寻出免疫反应阳性部位。根据作者经验，半薄切片可在相差显微镜下不染色进行观察（指PAP染色法），免疫反应部位呈黑点状。在HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。据此定位作超薄切片，可大大提高阳性反应检出率。为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，可取相连续的起薄切片，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。

包埋前染色法的优点是：①切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过程，抗原未被破坏，易于获得良好的免疫反应。②可在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。特别适用于含抗原量较少的组织，但由于经过一系列的免疫染色步骤，常出现一定的超微结构损伤。

2．包埋后染色 　组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片后，再进行免疫组化染色。由于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，故又名之载网染色（on grid staining）。必须指出的是：①后固定中是否应用四氧化锇存在不同意见，作者经验一般以不用四氧化锇为佳，或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。有作者认为，从理论上讲，四氧化锇具有保存抗原的作用，但实践证明应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。②在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选用镍网或金网。③在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网面干燥会影响抗体活性。本法的优点是超微结构保存较好，方法简便，阳性结构有高度的可重复性，还能在同一张切片上进行多重免疫染色。但抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失；环氧树脂中的环氧基，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质；包埋在环氧树脂中的环氧基，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质；包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。因此，免疫组化工作者曾试图以不同的方法如饱和苯溶液，无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等以减少或去除包埋剂，取得不同程度的效果。现普遍采用的是在进行免疫染色前，以H2O2液蚀刻数分钟，以去锇和增强树脂的穿透性。

3．超薄冰冻切片　　按照Tokuyasu建立的方法，将组织置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速冻，在冰冻超薄切片机上切片，切片厚度可略厚于常规树脂切片。冰冻超薄切片由于不需经固定、脱水、包埋等步骤，直接进行免疫染色，所以抗原性保存较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。

三、包埋

（一）树脂包埋

国内现普遍采用的是环氧树脂包埋法，可直接脱水后包埋，也可将小片组织或半薄切片贴在载片上，将充满环氧树脂的明胶囊倒置于切片上聚合、硬化，进行原位包埋。

（二）低温包埋

常规树脂包埋由于需高温聚合等处理程序，组织抗原性可能全部或部分丢失。因此，在免疫电镜技术方面，国外不少实验室已开始采用低温技术如低温包埋和冰冻超薄切片等，后者需配备冰冻超薄切片机，且技术难度较大，不如低温包埋法易推广。低温包埋剂的研究开始于60年代，80年代免疫细胞化学技术在电镜水平上的广泛的应用，为低温包埋剂的实验研究开辟了广阔的领域。国内已有较多的应用报道，国内一些实验室已开始摸索。作为低温包埋剂的多为乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycolmethacrylate,GMA）,Lowicryls, LR White和Lr Gold等，目前国外生产厂家有Polysciences INC , Reichert―Jung 和LKB等系列产品。现将常用的几种低温包埋剂及其应用简单介绍如下：

1．Lowicryls 是丙烯酸盐（acrylate） 和甲基丙烯酸盐（methacrylate）化学物质，包括K4M、HM20、K11M、KM23等系列产品（Polysciences INC），其特点是能在低温下保持低粘度（K4M：--35℃；HM20：-70℃；K11M、HM23：-60℃～-80℃）和具有在光照射（紫外光，波长360nm）下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无度。其中K4M和K11M具有亲水性，特别适合于免疫细胞化学的应用，因它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。所有这些种类的低温包埋剂都适用于冰冻置换技术。K4M的应用和报道较多，现侧重介绍如下：

（1）包埋剂的配制：商品提供的Lowicrys包埋剂由三个部分组成：单体（Monomer），交联剂（Crosslinker）和引发剂（Initator）。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下：

K4M：单体 　　17.30g

交联剂　　2.70g

引发剂　　0.10g

K11M：单体　　19.00g

交联剂　　1.00g

引发剂　　0.10g

作者的经验，可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻棒轻搅3～5min或用一小管通入液氮气泡以搅拌之。勿过分搅拌，以防氧的气泡进入包埋剂中。

（2）生物样品处理程序（Lemanski 等1985）

①动物麻醉取材，以多聚甲醛―赖氨酸―过碘酸钠在9℃固定2h。

②磷酸缓冲液含7%蔗糖，pH7.2,冲洗过夜，0℃

③0.1mol/L 磷酸缓冲液，pH7.2,冲洗，0℃

④脱水：65%乙醇，1h ,0℃

80%乙醇，2h,-35℃

Lowicryl K4M：80%乙醇=1：11h -35℃

Lowicryl K4M：80%乙醇=2：11h -35℃

100% Lowicryl K4M 1h -35℃

100% Lowicryl K4M 过夜-35℃

⑤包埋：新鲜K4M置于胶囊内，将组织移入，在-30℃～-40℃以紫外线灯波长360nm 2× 15W（Ladd Research Industries Burlington VT）相距30～40cm照射24h使之聚合。如为100W灯泡，照射距离应大于85cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。

（3）免疫染色

①切片（厚50～70nm）贴在金网或覆有碳膜的镍网上。所有下列步骤在室温、湿盒内进行。所有溶液需经微孔滤纸（0.25～0.45μm）滤过。

②正常羊血清30min。

③第一抗血清（PBS稀释），37℃2h。

④可用烧杯法（或塑料壶喷洗法），以镊夹镍网在第一烧杯中洗荡30min，然后在第二烧杯中洗荡1h 。

⑤正常羊血清30min。

⑥第二抗血清（胶金标记抗体）以正常羊血清稀释为1：1，以镍网置于血清滴上孵育1h。

⑦冲洗如④。

⑧覆于2%OSO4水溶液上，30min。

⑨冲洗如④。