上期小课堂，我们介绍了最基础的透射光技术，今天，继续给大家讲一讲宽场荧光显微镜。

Unit Two

在活体细胞成像应用中，宽场荧光显微镜有助于观察放置于显微镜载物台上特定的环境室中生长的粘附细胞的动力学特性。在最基本的配置中，配备有EPI荧光照明的标准倒置组织培养显微镜与区域阵列检测器系统（通常是CCD摄像机）、合适的荧光滤色片和光闸系统耦合，以限制细胞过度暴露于有害的激发光。基本荧光显微镜依靠精心匹配的干涉滤色片来选择特定的带宽用于照明和检测发射光。光源包括汞、氙气和金属卤化物弧光灯、光束扩展激光系统和发光二极管（LED），所有这些都需要不同的滤色片规格。用于荧光显微镜的合成荧光团具有覆盖近紫外、可见和近红外区域的发射光谱。基因编码荧光蛋白的应用极大地扩展了荧光显微镜在活细胞成像中的能力，使研究人员能够精确地瞄准感兴趣的亚细胞区域。

锘海自主研发的一款新型光片照明显微镜Nuohai LS 18，专为透明化大组织样品高分辨3D成像而设计，致力于探索脑，脾，小肠，肾，肺，心脏，肿瘤等多种完整器官的3D精准结构。

在宽场荧光中，显微镜物镜收集的全孔径发射光可以使记录的信号最大化，同时使所需的曝光时间最小化。因此，样本可以用非常短的光照周期成像。宽场成像的主要缺点是，从远离焦平面的区域产生的荧光以及背景信号都是没用的光，这些光通常会使感兴趣的特征模糊。因此，当感兴趣的特征很大（如细胞器）或本质上具有高度点状时，宽场成像可获得最佳结果。各种各样的活细胞样本，包括粘附细胞、细菌、酵母和非常薄的组织切片，是宽场荧光成像的理想候选，然而，较厚的组织（超过5微米）最好使用更先进的方法成像。

尽管合成荧光染料、量子点和荧光蛋白在荧光成像方面有许多进展，但在某些情况下，将荧光与其他成像方式结合起来是很有帮助的。举个例子，DIC可与宽场荧光（图5（c））结合使用，以监测细胞活力和一般形态，同时研究特定标记目标的感兴趣的现象。在单张图像中采集DIC和荧光通常是不切实际的，但在合适配置的显微镜中，这两种技术可以依次使用。因此，在落射荧光模式下成像后，可以使用透射光，从荧光标记的样本中采集DIC图像。这两个图像可以在后期分析过程中合并。先进的宽场显微镜配置中可以使用光谱分离照明（如可见光和近红外）和双摄像头或分视图摄像头适配器同时采集DIC和荧光图像。在大多数激光扫描共聚焦显微镜中，可以同时以荧光和DIC模式获取图像，从而消除了对采集后处理的需要。相差和霍夫曼调制对比（图5（d）和5（e））也可以与宽场荧光显微镜结合使用。然而，在这些技术中，物镜都是特殊的，无论是相位环还是霍夫曼调制板，都会导致5-15%的发射强度损失。

需要注意的是，当将DIC、相差或霍夫曼调制对比与荧光结合时，尤其是在活细胞成像中，通过DIC偏光器、物镜相位环或物镜后焦平面上的霍夫曼调制板的发射光损失可能很严重。在前一种情况下，在采集荧光图像之前，应将DIC偏光器和Nomarski棱镜从光路中移除，但相差物镜和霍夫曼物镜包含不能移除的光学元件。通过相位环或霍夫曼调制器的光损耗不如通过偏光器的光损耗严重，并且不会影响许多应用。然而，在使用弱荧光探针染色或具有低丰度目标的样本中，使用高透过率物镜获得灵敏度增益是至关重要的。

图5所示为使用宽场荧光显微镜单独或结合上述几种透射光技术拍摄的一系列图像。图5（a）显示了表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与人细胞角蛋白融合的活体人癌细胞（Hela细胞系）。粘附的Hela细胞大约有3到5微米厚，并在整个图像中保持聚焦。相比之下，因为不在焦平面内的荧光结构影响，厚组织标本在宽场荧光中很难分辨，（小鼠胃；图5（b））。宽场荧光可与多种透射光技术结合使用，包括DIC（小鼠肾切片；图5（c））、霍夫曼调制对比（小鼠胚胎细胞；图5（d））和相差（兔肾细胞；图5（e））。利用干涉滤光片组，可以连续对多个荧光团成像，以阐明活细胞中标记目标之间的时空关系（印度黄麂细胞；