实验方法原理 激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。

由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

实验材料 细胞

试剂、试剂盒 荧光染料水培养基

仪器、耗材 激光扫描共聚焦显微镜载玻片洗瓶滴管试管

实验步骤

一、观察及仪器操作 

1.  开启仪器电源及光源

一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。

2.  设置相应的扫描方式

在目视模式下．调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。

3.  获取图像

选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。

4.  关闭仪器

仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统．则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。

二、获取三维图像  

激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。选用“Z-Stack"模式，即可实现此项功能。

1.  开启“Z-Stack”选项。

2.  确定光学切片的位置及层数。

3.  启动“Start”，获得三维图像。

三、获取时间序列图像  

共聚焦显微镜的"Time-Series"功能，可以自动在实验者规定的时间内按照设定的时间间隔获取图像。只需设定所需的时间间隔以及所需图像数量，开启“Start T”功能键，即可进行实验。“Time-Series"功能大大减轻了实验者的劳动强度，对于荧光漂白恢复和钙离子成像等实验非常实用。

注意事项

1.  仪器周围要远离电磁辐射源；

2.  环境无震动，无强烈的空气扰动；

3.  室内具有遮光系统，保证荧光样品不会被外源光漂白；

4.  环境清洁；

5.  控制工作温度在5～25℃。