(4) 落射光激发的荧光法（incident-loght fluorescence Epi-FL）　简称为落射荧光法，是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法。它将激发荧光用的光源改在物镜的上方，光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品，从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜观察。该方法较简便，效率高，50W的光源强度比透射荧光法的250W还强。 荧光方法是利用波长较短的紫外光、紫光、蓝紫光、蓝光及绿光等去激发样品，只要样品中含有可产生荧光的成分，它便吸收短波的激发光而释放出波长较长的荧光。不同物质只能吸改特定波长的激发光，而释放的荧光也会有特定的波长，因而用作特异性的鉴定十分有效，如某些致病的细菌和螺旋体，受紫外光激发后能发出它们特有的荧光，很容易作出鉴定，这种利用物质吸收激发光后放出特有荧光的方法称为自发荧光法。某些物质自身不会吸收激发光，或吸收后不能释放荧光，但可以吸收或吸附特定的荧光色素或染料，而这些特定的荧光色素或染料也只能吸收特定的激发光，再释放出特定的荧光，从而间接地鉴别出某种物质，这称为间接荧光法。上述荧光方法广泛应用于医学、生物学及工业的特异性研究和鉴别上。调整方法：荧光显微镜或附有荧光部件的显微镜，调整的方法大致相同。     ① 汞灯的安装 a. 打开包装，取出汞灯将其小心安装在上电极散热帽上，安装时注意手指不能直接接触灯管和散热帽的正面，汞灯的封气口要对向散热帽的左侧或右侧； b. 把汞灯的上电极引张安装并固定在散热帽底面的小孔上，再把汞灯的下电极及上电极引线另一端，分别安装在灯座上各自的插孔中并固定； c. 锁紧散热片上的螺丝后，把汞灯连同灯座及散热帽小心装入灯室中，锁紧相应的螺丝，再把灯座上的连线和插座插到汞灯电源后部专用的插座上。 d. 详细的安装方法请参照有关说明书。     ② 汞灯灯室在显微镜外的初步调整： a. 接通汞灯电源，让汞灯预热10-15min； b. 把汞灯灯室摆放在桌面上，让汞弧投影到2-3m外的墙上，划一条与灯室窗口中心线对地高度一样的水平线作为参考线； c. 转动灯室调焦旋钮，使汞弧的像清晰地投影于墙上； d. 分别调节灯室外壳上的5个调节螺丝孔，把汞弧的像其反射像调成并排且尽量*近，但不要重叠在一起。     ③ 汞灯汞弧在显微镜内位置的检验： a. 将汞灯照明光路系统中的视场光阑开到最大； b. 把荧光滤光片组推到蓝光激发的位置上，以避免汞灯中的蓝光太刺眼； c. 把观察的样品或一块载玻片放在物台上，盖上一张比盖玻片稍大且洁白的薄纸； d. 取下一个物镜，使激发的蓝光经物镜转换器的空档照在白纸上，白纸上会有一蓝色的圆形照明区域，汞弧的像及其反射像都应该出现在这区域的中央部位，否则，可调节灯室调焦旋钮至最清晰，然后分别调节灯室外壳上的5个调节螺丝孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明区域的中央位置。 e. 调好之后，把物镜装回去，通过目镜可见白纸被蓝光激发后发射出的黄绿色荧光； f. 仔细调焦，可看清白纸的纤维；取去白纸，样品上的荧光细节隐约可见而很容易调焦清晰。     ④ 汞灯使用注意事项　目前通常使用的为50W超高气压汞灯，灯管内通有一对钨电极和液态汞（室温下附在管壁上），未点燃时，管内气压很低，在灯管的两电极间施加电压角发点燃后，汞气化为汞蒸气形成汞弧而产生强光，温度升高，管内气压迅速升到10个大气压。由于是高气压的气体放电，必须了解其特性才能安全地使用汞灯。 a. 汞灯接通电源后需要10-15min预热时间，汞才能充分汽化并形成汞弧，产生高亮度而稳定的激发光。因此，观察前要提早通电； b. 汞灯在使用过程中，不要随意开关汞灯的电源； c. 关掉汞灯电源后，必须等待15-20min，待汞灯自燃冷却后才可再次接通电源，违反这一操作规定时，将会造成严重后果！ 由于汞灯内的汞蒸气未完全液化，汞蒸气内阻很小，一旦通电在两电极间施加电压，汞灯内形成强大的电流，轻则烧断保险丝或烧毁汞灯电源中的扼流圈，重则汞灯爆炸，汞蒸气弥漫整个实验室，造成工作人员中毒，不仅损失了汞灯，还会炸毁灯室内的集光-聚光部件。 d. 汞灯的使用寿命一般只有300h，使用得当可达600h，使用寿命与开关的次数成反比，应集中一批样吕作2-3h的观察。汞灯价格及昂贵，应珍惜使用。 e. 汞灯寿命终结的标志是点燃困难，灯管发黑。 5. 暗视野法（dark field）　许多透明或半透明的样品，如细菌、微生物、细胞内的精细结构及结晶体的内含物等，在明视野显微镜中不容易看清楚，如果采用暗视野法就可以大大提高样品的可视度。以暗视野法所看到的是衬托在黑暗视野背景中发亮的样品轮廓及其细节。普遍光学显微镜的最高分辨率为0.2?m，而暗视野显微镜虽然对样品的细节构造分辨不清楚，但却可看到0.004?m以上微细颗粒的存在，即可以看到亚显微结构，特别适合用来观察微细的颗粒与细菌等。 调整方法：暗视野法的主要必需部件是暗视野聚光镜。使用时须先用明视野聚光镜把库勒照明系统调整好。换上暗视野聚光镜时，要把载玻片（样品）移开，将浸没油滴在聚光镜顶部，再把样品载玻片搁在物台上，浸没油便充填在两者之间，这种聚光镜须与装有可变光阑的100×油镜配用。另一种中倍率干式暗视野聚光镜可与中倍率的物镜配用，这种聚光镜具有中央光挡，照明光只能透过光档与聚光镜边缘之间的透光环才能进入聚光镜内。对于配备齐全的相差显微镜，与编号为Ph3物镜配用的相差聚光镜相差环，可以和 10×及10×以下的相差物镜配用而形成低倍率的暗视野效果。