相差显微镜是用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化（振幅差），这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。

相差显微镜使用中的几个问题：

1）相位倒转 当n’<n或n’>n时得到象的明暗反差正好相反，称为相位倒转。当 相位差δ=0时是无法识别的，随着δ的增大反差变大，当δ继续增大到某一值后会出现相位倒转。用90%高吸光值（高反差） 物镜时，这个转变值约为0.55λ，用70%标准吸光值的物镜时约为0.33λ。较高吸光值的物镜应该用于分辨较小的 光程差。

2）晕轮和渐暗效应 在相差显微镜成象过程中，某一结构由于相位的延迟而变暗时，并不是光的损失，而是光在象平面上重新分配的结果。因此在黑暗区域明显消失的光会在较暗物体的周围出现一个明亮的 晕轮。这是相差显微镜的缺点，它妨碍了精细结构的观察，当环状光阑很窄时 晕轮现象更为严重。相差显微镜的另一个现象是渐暗效应，指相差观察相位延迟相同的较大区域时，该区域边缘会出现反差下降。

3）样品厚度的影响 当进行相差观察时，样品的厚度应该为5μm或者更薄，当采用较厚的样品时，样品的上层是很清楚的，深层则会模糊不清并且会产生相位移干扰及 光的散射干扰。

4）盖玻片和载玻片的影响 样品一定要盖上盖上盖玻片，否则环状光阑的亮环和相板的暗环很难重合。相差观察对 载玻片和盖玻片的玻璃质量也有较高的要求，当有划痕，厚薄不均或凹凸不平时会产生亮环歪斜及相位干扰。另外玻片过厚或过薄时会使环状光阑亮环变大或变小。