实验概要

运用原子力显微镜(AFM)表征3种DNA纯化试剂盒对DNA的纯化效果。方法：PCR扩增K562/A02细胞mdr1基因DNA，分别以3种不同的DNA纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，按终浓度为10 ng・μl^-1固定在用1 ng・μl^-1 L型多聚赖氨酸预先处理过的新剥离的云母片上，用AFM获取DNA扫描图像，分析评价3种DNA试剂盒对DNA的纯化效果。

实验原理

原子力显微镜（atomic  force  microscope，AFM）是具有原子级分辨率的新一代显微镜，因其能够对DNA、蛋白质、磷脂生物膜、多糖等生物大分子以及有机化合物的形态及功能进行观察研究而引起了人们的广泛关注。近十几年，运用AFM在固相载体表面研究DNA分子技术取得的巨大进步，大大地增进了人们在分子层面上对DNA分子的了解。AFM在样本制备上相对较容易，但用于DNA研究时，要想得到质量较高的DNA图像对DNA样品的纯度要求较高。我们选择了3种不同的DNA纯化试剂盒对K562/A02细胞株mdr1基因769bp  DNA的PCR产物进行纯化后在相同条件下用AFM观测，通过比较，建议其中的两种可用于AFM的DNA样品的纯化。

主要试剂

1. 含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco/BRL公司产品)培养液

2. 酚/氯仿

3. 1ng・μl^-1 L型多聚赖氨酸(Sigma公司产品)

4. 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP2092，TIANWEI公司产品）

5. DNA小量胶回收试剂盒（W5211，2408A，Waston公司产品）

6. 琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（DV805A，TaKaRa公司产品）

主要设备

1. 37℃、5%CO₂培养箱

2. 低温冰箱

3. 紫外分光光度计

4. PCR仪

5. 紫外特摄仪

6. 电泳系统

7. Nanoscope AFM (Veeco/Digital Instruments，Santa Barbara，CA)

实验步骤

1. 细胞培养

K562/A02细胞株接种于含10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco/BRL公司产品)培养液，置于37℃、5%CO₂培养箱中常规培养，2~3d传代1次，实验前无药培养两周。

2. DNA提取

取对数生长期、终浓度2×105ml^-1的K562/A02细胞3ml，以酚/氯仿法抽DNA后，加100μl TE缓冲液于-20℃保存。用紫外分光光度计定量，要求A260/A280≥1.8。

3. PCR扩增

从基因库中查得所需mdr1的基因序列号，引物根据基因库提供的基因全序列用计算机软件Primer3设计，引物序列：上游5′ATACTTTACTCCTTCCTTCAA3′，下游5′TCTGAATAAAGTAGATTTCTTCATG3′，扩增K562/A02  细胞mdr1基因-758～＋11的DNA，片段长度为769bp。PCR反应体系：纯化的DNA模板2.5μ1，50pmol・L^-1上下游引物各1μ1，25mmol・L-1 MgCl₂ 1.5μ1，dNTP4μ1，5×PrimeStaRTM缓冲液(含Mg^2＋)10μ1，10mmol・L-1 PrimeStaR HS DNA聚合酶0.5U，余用灭菌去离子水补至50μ1。热循环参数为： 98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min；扩增30个循环。

4. 10g・L^-1琼脂糖凝胶电泳

取10μl PCR产物，加2μl溴酚蓝上样缓冲液，加入3个点样孔行1.0%琼脂糖凝胶电泳，在TAE电泳缓冲液中，电压5V・cm^-1，45min后取出凝胶置于紫外透射仪上显影拍照。

5. DNA纯化

在紫外特摄仪下切取3条含有清晰目的ＤＮＡ条带的凝胶块，分别用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP2092，TIANWEI公司产品）、DNA小量胶回收试剂盒（W5211，2408A，Waston公司产品）及琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（DV805A，TaKaRa公司产品）按相关说明书进行纯化，纯化样品于-20℃保存。

6. 样本的制备

用1ng・μl^-1 L型多聚赖氨酸(Sigma公司产品)预先处理新剥离的云母片(25px×25px)。多聚赖氨酸处理过的云母片用双面胶带粘附于甩膜机上，分别滴加以3种DNA纯化试剂盒纯化后，终浓度为10ng・μl^-1的K562/A02 细胞mdr1 DNA样品20μl于云母片中央，并在室温下作用2min，用7000r・min^-1离心，用吸量管吸1000μl去离子水滴加在旋转的云母片中央，冲洗3遍，时间持续1min，制备成3份DNA观测样品。

7. AFM观察和分析

样品使用Nanoscope AFM (Veeco/Digital Instruments，Santa  Barbara，CA)观测，在tapping模式下操作，像素密度为512×512，操作条件是室温、空气中，相对湿度不超过37%。用125μm  硅针尖tapping模式下共振频率为300~400kHz、针尖扫描频率为 1~2Hz进行扫描。获取扫描图像后，用Veeco/Digital  Instruments公司的程序软件将图像进行去噪声处理，获得清晰的DNA图像。通过图像分析，评价3种试剂盒对DNA的纯化效果。