以生物显微镜为例，讲述一下原理、构造和实验方法、步骤。

一、光学显微镜的原理

普通光学显微镜主要由物镜和目镜组成，均为凸透镜。物镜的焦距（f1）短，目镜的焦距（f2）长。物镜到标本（AB）的距离稍大于物镜（Lo）的焦距，标本经物镜放大后，形成放大倒立的实像A’B’，实像A’B是目镜的物体，它位于目镜的焦点以内，所以 A’B’经目镜（Le）再次放大后，形成放大的虚像A”B”（如图1）。

                          图1 光学显微镜成像原理

二、显微镜的结构：

普通光学显微镜由机械部分、照明部分和光学部分组成（如图2）。

                                      图2 光学显微镜结构

1. 机械部分：

显微镜的机械部分包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗调手轮、微调手轮等部件。

1）镜座：镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。其上连有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。底座和镜臂起稳定和支撑整个显微镜的作用。

2）镜筒： 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字通常标在物镜的外壳上。镜筒有单筒式、双筒式两种，单筒式镜筒又分直立和倾斜式，而双筒式镜筒均为倾斜式。

3）物镜转换器：物镜转换器上可安装三至四个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍和油镜）。转动转换器，可以按需要将其中的一个接物镜和镜筒对齐（注意是转动转换换选镜头，不能抓着物镜镜头转），与接目镜构成放大系统。

4）载物台：载物台中央有一孔，为光线通道。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定和移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。

5）推动器：是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们需要重复观察某一部分,可记下纵横标尺的数值，以后移动到同样数值即可找到。

6）粗调手轮（粗螺旋）：粗调手轮是快速移动调节接物镜和标本间距离的机件。

7）微调手轮（细螺旋）：用粗调手轮只可以粗略地调节焦距，要得到最清晰的物象，需要使用微距螺旋做精调。

2. 照明部分

安装在载物台的下方，由反光镜（或光源）、聚光器和光圈组成。

1）反光镜：早期光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜用以照明标本。也有用凹面镜会聚光线的。现代光学显微镜普遍采用电光源，无反光镜，并可调节光照强度。

2）聚光器：聚光器在载物台下面，它是由一组聚光透镜和升降螺旋组成的。聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。

3）光圈：聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，控制通过的光量，从而影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使视场外得不到光线的照明，以免散射光的干扰。

3. 光学部分

1）目镜：安装在镜筒上端，有单筒和双筒目镜，常用5×、10×、15×和20×的目镜。

2）物镜：安装在转换器上的接物透镜使被检物体成一次像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。一般有3-4个物镜（如图3），通常在物镜上标有主要性能指标即放大倍数和镜口率，如10/0.25、40/0.65和100/1.30。

                                           图3  显微镜物镜镜头

物镜的种类很多，可从不同角度来分类： 根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：

①干物镜  以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小于1。

②油浸物镜  常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90×~100×，数值孔值大于1。

数值孔径（numerical apeature，N.A.），也叫做镜口率（或开口率）。在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。物镜的性能取决于物镜的数值孔径，数值孔径越大，物镜的性能越好。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它反映该物镜分辨力的大小，数值越大，其分辨力越高。

工作距离指物像调节清楚时物镜下表面与盖玻片上表面之间的距离；物镜的放大倍数越大，工作距离越小。

2. 光学显微镜的使用方法及实验:

实验用品

材料与标本：字片、红绿羊毛交叉片、人血涂片。

器材：显微镜、擦镜纸。

试剂：香柏油、二甲苯(或乙醚-酒精混合液，比例为2:3）。

1）10×低倍镜的使用

①将显微镜放在离实验台边缘6~7厘米处（至少约一拳的距离）。

②打开显微镜的电源开关，然后使低倍镜对准镜台，开大光圈，上升聚光器并调节光亮调节旋钮至视野内光线明亮度适中。

③放置标本片：取一张载有标本的载玻片（以下简称玻片标本），先用肉眼观察，以确定止反面（载有标本的面为正面，一般都贴有标签）和标本的大致位置。再将玻片标本正面朝上放置在载物台并用弹簧夹夹好，用移动器移动片夹将玻片标本的标本移到载物台圆孔，聚光镜的正上方。

④调节焦距：从显微镜侧面注视物镜镜头，同时转动粗调手轮，使得载物台上升到最高（物镜头与标本片的距离约5mm处），然后一边在目镜上观察，一边缓慢转动粗调手轮，使载物台缓慢下降至视野中出现清晰的物像。

2）40×高倍镜的使用

①选择目标：一定先在低倍镜下把待观察部位移动到视野中心,将物像调节清晰。

②转换高倍镜物镜：为防止镜头碰撞玻片，可从显微镜侧面观察。慢慢地转动转换器使高倍镜头对准通光孔。

③调节焦距：观察目镜同时稍稍调节细调手轮，即可获得清晰的物像。若视野不够明亮，可上升聚光器和开大光圈。

3）100×油镜的使用

① 选择目标：在高倍镜下确定玻片标本上待观察部位并移至视野正中央。

② 转换油镜：转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在载物台圆孔上方的玻片标本处滴一滴香柏油。然后从侧面注视着镜头与玻片，慢慢转换油镜使镜头浸入油中。

③ 调节光亮：将聚光器升到最高位置，光圈开到最大。

④ 调焦：观察目镜同时调节细调手轮，使得物像清晰

若目标不理想或不出现物像需重找，在加油区之外重找应按：低倍→高倍油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，以免油沾污高倍镜头。

⑤ 擦拭油镜头：观察完毕，先用干的擦镜纸吸掉粘在油镜头上的油，再用擦镜纸条沾少许二甲苯(或乙醚-酒精混合液，比例为2:3)擦试镜头及周围，最后用干的擦镜纸擦干多余的二甲苯。⑥ 玻片标本上的油处理方法同上，只是因为玻片上的油较多，要重复2-3次才能擦干净。

4）实验记录结果与记录

①低倍镜的练习

比较肉眼直接观察字片与低倍镜下观察物像的有什么区别?左右前后移动玻片与低倍镜下观察到的物像有什么区别？

②高倍镜的练习

取红绿羊毛交叉片，先在低倍镜下找到羊毛，并将红绿羊毛的交叉点移到视野的中心，再换高倍镜观察，能否在交叉点同时看到两根羊毛（利用细螺旋进行判断）。

③油镜的练习

取人血涂片，先用低倍镜、高倍镜观察，再换油镜观察。比较三种放大倍数的物镜的分辨力并练习擦拭油镜头和标本片。

三、注意事项

移动显微镜时一定要一手握住镜臂，另一手托住底座。显微镜不能倾斜，以免目 镜从镜筒上端滑出。要轻拿轻放。

显微镜的光学部分，只能用特殊试镜纸纸擦拭，不得随意使用其它物品擦拭，更不可用手指触摸透镜，以免汗液玷污透镜。

需要更换标本片时，将物镜头转离载物台 ，方可取下或放置标本片。

保持显微镜的清洁，避免灰尘、水及化学试剂的玷污。

转换物镜镜头时，不要搬动物镜镜头，应转动转换器。

切勿随意转动粗准焦螺旋。使用细准焦螺旋时，用力要轻，转动要慢，转不动时不要硬转。

不得任意拆卸显微镜上的零件，严禁随意拆卸物镜镜头，以免损伤转换器螺口，或螺口松动后使低高倍物镜转换时不齐焦、破坏光轴重合。

在使用高倍物镜时，不要用粗准焦螺旋调节焦距，以免移动间隔过大，损伤物镜和玻片。

保持显微镜的干燥。

显微镜使用完毕，必须复原，其具体步骤是：先转动转换器使物镜头离开通光孔，再取下标本片，下降载物台，下降聚光器、关闭光圈，玻片移动器回位，将显微镜电光源的亮度调到最暗，再关闭电源，盖上绸布和外罩，最后将显微镜放在桌子的中央。