实验方法原理

一、电子显微镜的分辨力和放大率

 

电子显微镜是利用电子流代替光学显微镜的光束使物体放大成像而由此得名的。发射电子流的电子源部分称为电子枪，电子枪由发射电子的“V”形钨丝及阳极板组成，在高真空中，钨丝被加热到白炽程度，其尖端便发射出电子，发射出来的电子受到阳极很高的正电压的吸引，使电子得到很大的加速度而到达样品。电压越高，电子流速度越快，波长越短，其分辨能力也越强。一般用50-100 kV电压时，电子波长在0.54-0.37 nm，所以电子显微镜的分辨力极高，可达0.2 nm左右，此分辨力比光学显微镜提高了近1 000倍。

 

在电子流的通路上不能有游离的气体分子存在，否则由于气体分子与电子的碰撞而造成电子的偏转，导致物像散乱不清。因此，电子显微镜除需要高电压外，还需要高真空的装置。

 

电子显微镜的放大率是由透镜决定的，在电子显微镜中，透镜是由看不见的电磁场构成的，称为电磁透镜，简称磁透镜。由电子枪发射出的电子流可以通过磁透镜的磁场吸引发生偏折而放大物体，这与光学显微镜的光线通过玻璃透镜发生折射而放大物体的情况一样，但它不同于光学显微镜的是可利用多个磁透镜的组合而得到逐级放大的电子像，所以现代电子显微镜的成像系统由多个电磁透镜组成。而光学显微镜由于玻璃透镜本身存在有相差的缺陷，其放大率不能通过增加透镜的数目来无止境地提高。

 

此外，通过改变这些电磁透镜的磁场强度也可提高放大率。磁场越强，焦距越短，放大倍数也就越大。所以现代电子显微镜的成像物镜大多数采用短焦距的强磁透镜，放大倍数可达一百万倍以上。

 

二、电子显微镜的成像原理

 

任何一个物体都是由原子组成的，原子则是由原子核与轨道电子组成的。当电子束照射到样品上的时候，一部分电子能从原子与原子之间的空隙中穿透过去，其余的电子有一部分会与原子核或原子的轨道电子发生碰撞被散射开来；一部分电子从样品表面被反射出来；还有一些电子是被样品吸收以后，样品激化而又从样品本身反射出来等。如果把所有这些不同类型的电子收集起来，使它们成像，便可以构成不同类型的电子显微镜。这里只着重介绍透射电子显微镜和扫描电子显微镜。

 

1.  透射电子显微镜

 

透射电子显微镜收集的是透过样品的电子。在透射电子显微镜中，物像的形成主要来自电子的散射作用与干涉作用。散射作用分“弹性散射”和“非弹性散射”两种。弹性散射指电子和原子核发生碰撞，电子基本上不损失能量，而只是改变运动方向，这种碰撞称为弹性碰撞，这时候我们说电子发生了“弹性散射”作用。如果电子是和轨道电子发生碰撞，电子不仅会改变原来运动的方向，而且还会损失一部分能量，这时电子便发生了“非弹性散射”作用。

 

由于物体上不同部位的结构不同，它们散射电子的能力也各不相同，结果使透过样品的电子束发生疏密的差别，在散射电子能力强的地方，透过去的电子数目少，因而打在荧光屏上所发出的光就弱，显现为暗区；而散射电子能力弱的地方，透过的电子数目多，打在荧光屏上所发出的光就强，显现为亮区，这样，便在终像上造成了有亮有暗的区域，因而出现了反差，人眼就可以辨别。散射作用形成的反差造成强度上的变化，因此又称为“振幅反差”。由于在电子显微镜中利用的是人眼看不见的电子流，所以通常用一块荧光屏来把电子流转换成可见的荧光，使人眼可以接受。

 

除了散射作用能引起反差外，电子的干涉作用也能造成反差，在电子发生非弹性碰撞的时候，由于电子会失去一部分能量，因而使它前进的速度变慢，这部分速度减慢的电子会和速度不变的电子发生干涉作用，结果造成电子相位上的变化，从而也引起反差，称为“相位反差”。

 

在低倍观察时，振幅反差是主要的反差来源，而在高倍观察时，也就是在辨别极小的（如1 nm大小）细微结构时，相位反差则起主要作用。

 

2.  扫描电子显微镜

 

与透射电子显微镜不同，扫描电子显微镜是把从样品表面反射出来的电子收集起来并使它们成像，所以又称反射电子显微镜。扫描电子显微镜的成像原理与电视或电传真照片的原理相似，由电子枪产生的电子束经过三个磁透镜的作用，形成一个很细的电子束，称为电子探针。电子探针经过透镜聚焦到样品表面上，按着顺序逐行逐行地通过样品，也就是对样品扫描，然后把从样品表面发射出来的各种电子（二次电子、反射电子等）用探测器收集起来，并转变为电流信号经放大后再送到显像管转变成图像。

 

扫描电子显微镜主要用来观察样品的表面结构，分辨力可达10 nm，放大范围很广，可从20倍到几十万倍。透射电子显微镜的分辨力虽然很高，但是一般只能观察切成薄片后的二维图像，扫描电子显微镜能够直接观察样品表面的立体结构，并且具有明显的真实感。许多电子无法透过的较厚样品，只能用扫描电子显微镜才能看到。

 

 

实验材料 大肠杆菌

试剂、试剂盒 浓硫酸醋酸戊脂醋酸戊脂浓硫睃NaOH乙醉无菌水磷钨酸钠 聚乙烯甲醛三氯甲烷细胞色素c醋酸铵质粒pBR322

仪器、耗材 普通光学显微镜镊子铜网瓷漏斗烧杯平皿滴管大头针载玻片细菌计数板真空镀膜机临界点干燥仪

实验步骤

一、金属网的处理

光学显微镜的样品是放置在载玻片上进行观察，而在透射电镜中，由于电子不能穿透玻璃， 只能采用网状材料作为载物，通常称为载网，载网因材料及形状的不同可分为多种不同的规格， 其中最常用的是200〜400目（孔数）的铜网，网在使用前要处理，除去其上的污物，否则会影响支持膜的质量及标本照片的清晰度，本实验选用的是400目的铜网，可用如下方法进行处理：首先用醋酸戊酯浸漂几小时，再用蒸馏水冲洗数次，然后再将铜网浸漂在无水乙醇中进行脱水，如果铜网经以上方法处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（1:1）浸1-2 min，或在1%NaOH溶液中煮沸数分钟，用蒸馏水冲洗数次后，放人无水乙醇中脱水，待用。

二、支持膜的制备

在进行样品观察时，在载网上还应覆盖一层无结构、均匀的薄膜，否则细小的样品会从载网的孔中漏出去，这层薄膜通常称为支持膜或载膜，支持膜应对电子透明，其厚度一般应低于20 mm在电子束的冲击下，该膜还应有一定的机械强度，能保持结构的稳定，并拥有良好的导热性；此外，支持网在电镜下应无可见的结构，且不与承载的样品发生化学反应，不干扰对样品的观 察，其厚度一般为15 nm左右，支持膜可用塑料膜（如火棉胶膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金属膜（如铍膜等）。常规工作条件下，用塑料膜就可以达到要求，而塑料膜中火棉胶膜的制备相对容易，但强度不如聚乙烯甲醛膜。

1.  火棉胶膜的制备

在一干净容器（烧杯、平皿或下带止水夹的瓷漏斗）中放入一定置的 无菌水，用无菌滴管吸2%火棉胶醋酸戊酯溶液，滴一滴于水面中央，勿振动，待醋酸戊酯蒸发，火膜胶则由于水的张力随即在水面上形成一层薄膜，用镊子将它除掉，再重复一次此操作，主要是为了清除水面上的杂质，然后适量滴一滴火棉胶液于水面，火棉胶液滴加量的多少与形成膜的厚薄有关，待膜形成后，检查膜是否有皱折。如有，则除去一直待膜制好。

所用溶液中不能有水分及杂质，否则形成的膜的质量较差，待膜成型后，可从侧面对光检查所形成的膜是否平整及是否有杂质。

2.  聚乙烯甲醛膜（formvar膜）的制备

（1）洗干净的玻璃板插人0.3% formvar溶液中静置片刻，时间视所要求的膜的厚度而定，然后取出稍稍晾干便会在玻璃板上形成一层薄膜；

（2）用锋利的刀片或针头将膜刻一矩形；

（3）将玻板轻轻斜插进盛满无菌水的容器中，借助水的表面张力作用使膜与玻片分离并漂浮在水面上。

所使用的玻片一定要干净，否则膜难以从上面脱落；漂浮膜时，动作要轻，手不能发抖，否则膜将发皱；同时， 操作时应注意防风避尘，环境要干燥，所用溶剂也必需有足够的纯度，否则都将对膜的质量产生不良影响。

三、 转移支持膜到载网上

转移支持膜到载网上，可有多种方法，常用的有如下二种：

1.  将洗净的网放人瓷漏斗中，漏斗下套上乳胶管，用止水夹控制水流，缓缓向漏斗内加人无菌水，其量约髙1 cm；用无菌镊子尖轻轻排除铜网上的气泡，并将其均匀地摆在漏斗中心区域；按2所述方法在水面上制备支持膜，然后松开水夹，使膜缓缓下沉，紧紧贴在铜网上；将一清洁的滤纸覆盖在漏斗上防尘，自然干燥或红外线灯下烤干。干燥后的膜，用大头针尖在铜网周围划一下，用无菌摄子小心将铜网膜移到载玻片上，置光学显微镜下用低倍镜挑选完整无缺、厚薄均匀的铜网膜备用。

2.  按2所述方法在平皿或烧杯里制备支持膜，成膜后将几片铜网放在膜上，再在上面放一张滤纸，浸透后用镊子将滤纸反转提出水面。将有膜及铜网的一面朝上放在干净平皿中，置40℃烘箱使干燥。

四、制片

透射电镜样品的制备方法很多，如超薄切片法、复型法、冰冻蚀刻法、滴液法等，其中滴液法，或在滴液法基础上发展出来的其他类似方法如直接贴印法、喷雾法等主要被用于观察病毒粒子、细菌的形态及生物大分子等。而由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等元素组成，散射电子的能力很低，在电镜下反差小，所以在进行电镜的生物样品制备时通常还须采用重金属盐染色或金属喷镀等方法来増加样品的反差，提高观察效果。例如负染色法就是用电子密度高，本身不显示结构且与样品几乎不反应的物质（如磷钨酸钠或磷钨酸钾）来对样品进行染色。由于这些重金属盐不被样品成分所吸附而是沉积到样品四周，如果样品具有表面结构，这种物质还能穿透进表面上凹陷的部分，因而在样品四周有染液沉积的地方，散射电于的能力强，表现为暗区，而在有样品的地方散射电子的能力弱，表现为亮区。这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。 负染色法由于操作简单，目前在进行透射电镜生物样品制片时比较常用。本实验将主要介绍采用滴液法结合负染色技术观察细菌及核酸分子的形态。

1.  细菌的电镜样品制备

（1）将适量无菌水加人生长良好的细菌斜面内，用吸管轻轻拨动菌体制成菌悬挂液，.用无菌滤纸过滤，并调整滤液中的细胞浓度为108〜109个/毫升。

（2）取等量的上述菌悬液与等量的2%的磷钨酸钠水溶液混合，制成混合菌悬液。

（3）用无菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。

（4）经3~5 min后，用滤纸吸去余水，待样品干燥后，置低倍光学显微镜下检查，挑选膜完整、菌体分布均匀的铜网，有时为了保持菌体的原有形状，常用戊二醛、甲醛、锇酸蒸气等试剂小心固定后再进行染色。其方法是将用无菌水制备好的菌悬液经过滤，然后向滤液中加几滴固定液（如pH7.2，0.15%的戊二醛磷酸缓冲液），经这样预先稍加固定后，离心，收集菌体，制成菌悬液，再加几滴新鲜的戊二 醛，在室温或冰箱内固定过夜。次日离心，收集菌体，再用无菌水制成菌悬液，并调整细胞浓度为108〜109个/毫升。然后按上述方法染色。

2.  核酸分子的电镜样品制备

图2  用电镜检测质粒DNA的方法示意图

核酸分子链一般较长，采用普通的滴液或喷雾法易使其结构受到破坏，因此目前多采用蛋白质单分子膜技术来进行核酸分子样品的制备。其原理是：很多球状蛋白均能在水溶液或盐溶液的表面形成不溶的变性薄膜，在适当的条件下这一薄膜可以成为单分子层，由伸展的肽链构成为一个分子网，当核酸分子与该蛋白质单分子膜作用时，会由于蛋白质的氨基酸碱性侧链基团的作用，使得核酸从三维空间结构的溶液构型吸附于肽链网而转化为二维空间的构型，并从形态到结构均能保持一定程度的完整性。最后将吸附核 酸分子的蛋白质单分子膜转移到载膜上，用负染等方法增加样品的反差后置电镜观察。可用展开法、扩散法、一步稀释法等使核酸吸附到蛋白质单分子膜上，本实验采用展开法。

 

（1）将质粒pBR322与一碱性球状蛋白溶液（一般为细胞色素c）混合，使浓度分别达到0.5〜2  mg/ml和1 mg/ml，并加人终浓度为0.5〜1 mol/L的醋酸铵和1 mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，成为展开溶液，pH为7.5。

（2）在一干净的平皿中注人一定下相溶液（蒸馏水或0.1~0.5  mol/L的醋酸铵溶液），并在液面上加人少量滑石粉。将一干净载玻片斜放于平皿中，用微量注射器或移液枪吸取50 微升的展开溶液，在离下相溶液表面约1 cm左右的载玻片上前后摆动，滴于载玻片的表面，此时可看到滑石粉层后退，说明蛋白质单分子膜逐渐形成，整个过程约需2~3 min。载玻片倾斜的角度决定了展开液下滑至下相溶液的速度，并对单分子膜的形成质量有影响，经验证明倾斜度以15°左右为宜。在蛋白形成单分子膜时，溶液中的核酸分子也同时分布于蛋白质基膜中间，并略受蛋白质肽链的包裹，理论计算及实验证明，当1 mg的蛋白质展开成良好的单分子膜时，其面积约为1 m2， 因而可根据最后形成的单分子膜面枳的大小估计其好坏程度。如果面积过小，说明形成的膜并非单分子层，因而核酸就有局部或全部被膜包裹的危险，使整个核酸分子消失或反差变坏。

在单分子膜形成时整个装置最好用玻璃罩等盖住，以防操作人员的呼吸和旁人走动等引起气流的影响以及灰尘等脏物的污染。另外，在展开溶液中可适量加入一些与核算量相差不悬殊的指示标本，如烟草花叶病病毒等，以利于鉴定单分子膜的展开剂后面转移的好坏。

（3）单分子膜形成后，用电镜镊子取一覆有支持膜的载网，使支持膜朝下，放置于离单分子膜前沿1 cm或距离载玻片0.5 cm的膜表面上，并用镊子即刻捞起，单分子膜即吸附于支持膜上。多余的液体可用小片滤纸吸去，也可将载网直接漂浮于无水乙醉中10-30 s。

（4）将载有单分子膜的载网置于10-3-10-5 mol/L的醋酸铀乙醇溶液中染色约30 s（此步可在用乙醇脱水时同时进行）或用旋转投影的方法将金属喷镀于核酸样品的表面。也可将二种方法结合起来，在染色后再进行投影，其效果有时比单独使用一种方法更好一些。

五、观察

将载有样品的铜网置于透射电镜中进行观察。