激光共聚焦显微镜的基本原理与功能
激光共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,把光学成像的分辨率提高了30%--40%,使用紫外或可见光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值,膜电位等生理信号及细胞形态的变化,成为形态学,分子生物学,神经科学,药理学,遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等,观察研究组织切片,细胞活体的生长发育特征,研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究(RATIO),神经递质研究,微分干涉及荧光的断层扫描,多重荧光的断层扫描及重叠,荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件,荧光共振能量的转移的分析,荧光原位杂交研究(FISH),细胞骨架研究,基因定位研究,原位实时PCR产物分析,荧光漂白恢复研究(FRAP),胞间通讯研究,蛋白质间研究,膜电位与膜流动性等研究,完成图像分析和三维重建等分析。
基本原理
传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰;激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光点倍增管(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
激光共聚焦显微镜主要组成部分及功能:
1.照明针孔
功能:使激光经过照明针孔后形成点光源,点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与探测器针孔及焦平面形成共聚焦装置。
2.光束分离器
功能:将样品激发荧光与其他非信号光线分开。
3.物镜
4.焦平面
功能:激光点光源照射物体在焦平面处聚焦,激发荧光标记的样本发射荧光,形成焦点光斑。该光斑经过物镜,光束分离器等一系列装置的处理,分别在照明针孔及探测器针孔两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。
5.探测器针孔
功能:起到空间滤波器的作用。大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光,以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置,因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息(两点共轭)。
6.光电倍增管(探测器)
功能:接受通过针孔的光信号,转变为电信号传输至计算机,在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。
7.激光器:共聚焦显微镜技术的发展离不开激光器的飞速发展。我们可以根据研究需要选择不同的激光器。比如AArUV(351.364nm),HeCd(442nm),AR(457,488,514nm),ArKr(488,568,647nm),Kr(568nm),HeN e(543nm),HeNe(633nm)等。
8.多荧光通道:具有多个荧光通道,以实现同时对样品进行多种标记。