一、实验目的

1.了解显微操作仪的结构、原理及使用方法。

2.了解细胞显微注射的基本原理。

3.掌握细胞显微注射的基本技术。

二、实验原理

显微注射技术是在倒置显微镜下，借助于显微操作系统将外源的目的基因、特定的分子探针单个精子或细胞核直接注入到活体靶细胞中的技术。是建立试管动物、试管婴儿、转基因动物等极为重要的技术方法，同时也为研究动、植物细胞的发育和细胞功能的调控机制提供了新的手段。

它的不足之处是：需要昂贵精密的设备（显微操作仪），显微注射操作复杂，需要业务的专业技术人员。

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三、实验用品

1.器具：倒置显微镜、显微操作仪、显微注射仪、电热式拉针仪、熔针仪、磨针仪、微型玻璃吸管和玻璃针、细胞融合仪、细胞培养箱、超净工作台、培养皿、盖玻片。

2.药品：生理盐水、PBS缓冲液、乙醇、盐酸、缓冲培养基（含25mmol/LHEPES,pH7.2）、注射缓冲液[10mmol/LH₂PO-₄ 和H₂PO-₄（pH7.2）、84mmol/LK+、17mmol/LNa+、1mmol/L EDTA]。

3.材料：培养的细胞、斑马鱼卵或青蛙卵。

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四、实验方法

㈠材料准备

1.微注射针头的拉制

在电热式拉针仪上装上一根毛细管拧紧两侧的夹子。设定好电流、拉力和时间后，按开始键将毛细管拉成两个所需的微注射针头。

2.盖玻片的处理

⑴将盖玻片放在陶瓷或金属架上，相互不要接触。

⑵在装有自来水的烧杯中，快速浸泡和冲洗。

⑶在纸巾上把架子空干，再放入盛有0.1mol/L HCl的烧杯中，温育过夜。

⑷用自来水冲洗盖玻片5次，每次10min。

⑸把架子进入70%的乙醇中，温育60min。

⑹用去离子水短暂冲洗，放在纸巾上空干。

⑺在室温下自然干燥30min.

⑻在220～250℃烤6h.

3.显微注射用细胞（受体细胞）的准备

⑴倒置显微镜：在注射的前一天，将细胞铺到直径为10～15mm的盖玻片上，每个盖玻片上250～1000个细胞。

⑵倒置显微镜：在注射前，把带有需要注射细胞的盖玻片转移至新的组织培养皿中，迅速用已经灭菌的金刚石笔在盖玻片上划一个十字或一个圆圈标记，然后加入3ml有缓冲液的培养基。

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㈡显微注射操作过程

1.注射微细管针头定位

⑴倒置显微镜：将载有待注射细胞的盖玻片转移到里面有缓冲液培养基的平面皿中，将其放在*。

⑵倒置显微镜：将培养皿放在显微镜的载物台上，尽量将盖玻片上所画圆圈的一个对准光照的中心区。

⑶倒置显微镜：用低倍镜对准细胞调焦。

⑷倒置显微镜：将针头推入视野中心，在视野中针头诚阴影状。

⑸倒置显微镜：轻轻落下针头，直到培养基中后停下。

⑹倒置显微镜：通过显微镜观察，移动针头，直到针头阴影在视野的上方，然后确定针头的位置，使其处在视野的中心。

⑺倒置显微镜：轻轻下调针头，直到针头变的清晰一些。

⑻倒置显微镜：调至工作放大倍数，调准焦距，找到针尖。

⑼倒置显微镜：小心下调针尖，直到其完全聚焦清晰。

2.显微注射操作

⑴用注射微细管吸取注射样品。

⑵用握持微细管吸附并固定住受体细胞。

⑶调整注射微细管针尖位置，使针尖对准受体细胞。

⑷移动注射微细管针尖，使其进入受体细胞。

⑸使用显微注射仪施加注射压，将注射样品注入受体细胞。

⑹轻轻上提注射微细管，直到离开已注射细胞。

⑺移动显微镜载物台，找到下一个细胞，重复1～6步骤。

五、注意事项

1.显微操作仪属于精密仪器，在使用时一定要严格按照操作流程进行，以免损坏仪器。

2.注射速度过快将扰乱细胞质成分，造成细胞破裂后细胞移位。

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