处理数据

应对高速且大量的数据

光片显微镜的一个显著优点是能够在数小时（或数天）内以非常高的时间与空间分辨率对大样本进行成像，但由此导致的结果是会产生巨大的数据量，很容易达到TB级别，于是样本成像的速度不再受图像采集速度的限制，而是受数据处理电脑、存储容量和数据传输速度的限制。

当以中等帧速成像时，相机采集的数据可以简单地通过消费级市场标准的连接（例如USB或FireWire）传输到采集电脑的存储磁盘，甚至使用网络连接传输到云端的普通存储电脑。如果使用速度更快的相机，数据传输速度将会成为限制。有些相机允许图像数据流保存到内部存储器，需要在采集后读出；其他相机则选择采用更快的数据连接，这在大多数情况下需要在计算机中安装额外的硬件（图像采集卡）。然后，数据流要么传输到足够大的主存储器，要么以同样快的速度（避免数据丢失）传输到专用的数据存储设备。

还有一种办法则是通过图像压缩来降低数据量。图像数据可以在相机、图像采集卡、处理器（CPU）或图形处理卡（GPU）中压缩。这样的确能直接减轻数据传输和存储系统的压力，但增加了对压缩和随后解压缩的处理能力的需求。

解决数据量问题的一个更有效的选择是在拍摄前预定义感兴趣的区域（ROI），并仅存储这些区域的数据。这种实时处理的方法一般是为特定的某个标本或科学问题定制的，但可以使图像数据本身减少很多。同时，在处理过程中数据已经很好地被可视化，以便于进一步的数据分析。理想情况下，显微镜（或相机）应该直接输出预处理和压缩后的数据，或者，如果可能的话，直接输出最终结果（图5-1）。

（图5-1）

图 5-1 处理光片显微镜数据集

 光片显微镜所产生的大量数据需要强大的数据处理基础设施。传统的成像实验方法（顶行）是从相机获取样本的图像数据开始，在预处理（如转换和裁剪等）之后，对数据进行处理（如滤波、配准和分割等）和分析（如细胞追踪等），然后才能得到最终结果。一些自定义方法（中间行）可以在特定成像实验中实时进行数据预处理，并减少后续处理和分析步骤的负担。最理想的情况是显微镜甚至相机本身可以直接输出最终结果，而无需对原始数据进行任何存储、传输和处理（最后一行）。

另一种可能性是智能显微镜，它能更进一步，不预先定义ROI，而是让显微镜选择分别以何种分辨率拍摄哪些区域。智能显微镜这样的选择可以基于现有的，或者之前所拍摄的相似样本的数据。

5.2 图像增强

由于通过光片显微镜采集的图像数据优秀的信噪比和整体图像质量，在获得数据后通常不需要进行过多的增强、去噪或恢复步骤。如有必要，用于共聚焦显微镜或宽场显微镜所采集图像数据的各种滤波器也可用于光片显微镜的图像数据。

5.3 多视图融合

从多视图获取图像数据（见光片技术小课堂四4.1）之后，一个必要的处理步骤是多视图融合。第一步是在空间中相互配准各个视图，这可以通过基准标记（如荧光珠，见光片技术小课堂三3.1）、样本内的结构（如荧光核）或采集过程中相对位移位置的精确信息来实现。一旦配准，可以通过平均图像强度或以基于内容的方式来融合图像数据。多视图融合的结果是继承了每个视图最佳特征的单个数据集。最终，使用者们会希望实时执行这种多视图融合，以便只保存最终融合，而不保存任何原始数据。

5.4 图像分析

光片显微镜和其他传统显微镜，例如共焦显微镜，的图像分析方法没有太大区别。数据集可能需要进行三维重构，数据对象可能需要进行分割和追踪，可能需要在空间和时间上测量信号强度，还可能需要分析多个通道之间的相关性。对于共定位研究和荧光定量，必须的注意一点是靠近视野边缘时的光片形态和强度的变化，因为这会影响照明和荧光激发。因此，使用者应仔细检查光片参数（见光片技术小课堂四4.2），并使用选定的基准标记验证x、y和z中每个通道的重叠。

在大多数情况下，光片显微镜所获取的图像数据与普通光学显微镜的主要区别通常是数据量过大。光片显微镜所获取的高空间与时间分辨率的数据需要更强大的计算能力，并且这尤其适用于延时数据的分析。普通的分析工具通常需要将整个数据集加载到内存中，而对于光片显微镜的图像数据来说，这通常是不可能的。与普通的光学显微镜实验相比，使用者必须谨慎考虑所需的分辨率：最高的可能速度、最大的视野和最高的分辨率可能听起来非常美好，但数据量的快速增加也会使后续分析变得更加困难。

参考文献：

1. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., & Huisken, J. (2012). Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development, 139(17), 3242–3247. 

2. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., & Tomancak, P. (2010). Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nature Methods, 7(6), 418–419. 

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4. Schmid, B., Shah, G., Scherf, N., Weber, M., Thierbach, K., Campos, C. P., et al. (2013). Highspeed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications, 4, 2207.