实验概要

本实验介绍了细胞瞬时转染与传代、细胞的裂解及共聚焦显微镜观察。

主要试剂

1. 裂解缓冲液配方：

1%NP-40，100mM NaCl，20mM TRis pH8.0，5mM EDTA，5mM MgCl₂，10% Glycerol。

2. 细胞培养液成分：

RPMI1640基本培养液 10%胎牛血清 1%三抗。

3. Trypsin-EDTA

4. 磷酸缓冲液(PBS，pH7.3 )

5. 裂解缓冲液(用前补加蛋白酶抑制剂，和0.1 %OG)

6. 4%甲醛

7. 0.1 % Triton X-100

8. 封闭液(甘油：PBS=1：1)

主要设备

1. TCS-SP2激光共聚焦显微镜(，Mannheim，Germany)

2. 细胞培养箱37℃

3. 荧光显微镜

实验材料

HEK293细胞

实验步骤

1. 细胞瞬时转染与传代

    1) 测定质粒浓度；

    2) 将4ug质粒加入到4ul PEI，混匀，静置1 min后，加入100u1培液中混匀，静置l 0min；

    3) 为HEK293细胞换取2ml新鲜培养液，将转染样品均匀加到培养皿中，轻轻混匀，置于37℃细胞培养箱中培养，3h后换成正常培养液；

    4) 次日在荧光显微镜下可观察到表达荧光蛋白的细胞；

转染HEK293细胞的传代方式和正常HEK293细胞的传代方式一致。HeLa细胞的转染与传代与此相同。

2. 细胞的裂解

裂解前一天换液保证细胞状态，裂解前将培养液吸出，每皿加200ul的Trypsin-EDTA处理3min，加入1 ml培养液终止消化，悬浮转移至EP管1000rpm离心3min，弃上清，加入DPBS悬浮同样再离心弃上清。重复2遍，然后加入100uI裂解缓冲液(用前补加蛋白酶抑制剂，和0.1 %OG)。冰浴30min，15000 rpm15min收上清。

3. 共聚焦显微镜观察

培养皿中细胞首先用新鲜配制的磷酸缓冲液(PBS，pH7.3 )洗三遍，每次5min。用新鲜配制的4%甲醛4℃固定30min，PBS洗三遍，每次5min。然后用0.1 % Triton X-100破膜15min，PBS洗三遍，每次5min。吸干溶液，加封闭液(甘油：PBS=1:1)和盖玻片，用指甲油固定好盖玻片。使用 TCS-SP2激光共聚焦显微镜(，Mannheim，Germany)观察，使用 X 63的油镜镜头。