如何使用荧光显微镜观察细胞
免疫荧光
IF是一种通过荧光基团标记检测细胞内有机分子，胞内定位及其相互作用关系的成像研究手段。IF制剂可通过多种显微镜技术（如激光共聚焦、宽场荧光、全内反射成像等）来加以分析，具体取决于应用目的或研究人员的关注重点。与此同时，在很多使用至少一套简易荧光显微镜的研究工作组当中，IF早已成为不可缺少的一部分。
IF实验的核心部分是两种不同组分的组合：
首先是特异性抗体，用于形成免疫复合物来标记细胞内需要研究的分子，大多数情况下为蛋白质。
其次是荧光色素，与免疫复合物耦合，可以利用显微镜进行观察目标结构。
图1：图中显示了间接免疫荧光的典型工作流程，上皮细胞粘附在盖玻片上生长。培养后细胞被固定，因此用化学交联剂（如甲醛）将其杀死。再用清洁剂进行透化处理，使抗体穿过细胞膜。用正常血清、奶粉或牛血清白蛋白来进行封闭，可减少抗体与非靶向结构的非特异性结合，从而减少假阳性信号。接下来与一抗进行孵育，特异性识别靶向分子上的表位。在第二个培育步骤中，应用荧光耦合二抗，与一抗结合来实现靶向结构的可视化观察。抗体孵育后，用DAPI或Hoechst等嵌入DNA的染料进行细胞核染色。在显微镜载玻片上涂有封固介质（例如Mowiol或Prolong Gold）的盖玻片后，IF即已准备好进行显微镜观察。
直接与间接免疫荧光
根据实验类型的不同，有两种不同的IF变体可以使用：第一种是直接IF或一级IF，一种具有特异性的一抗，能够与荧光色素连接用于结合靶向结构并实现直接可视化观察。
第二种变体是指间接或二级IF，这种变体需要采用两步式培育。首先，特异性一抗识别靶向结构。然后应用与一抗特异结合的荧光色素耦合二抗。这种特异性是通过引导二抗抵御产生一抗的物种而获得的（见‘抗体和荧光色素’章节）。比较两种IF变体可见两者各有不同的优缺点：
通过耦合一抗和荧光色素，耗时的清洗和培育步骤被省略，所以直接IF比间接IF更快。因此，直接IF更易于处理，适合于在标准IF实验中（例如在临床实践中）对样本进行快速分析。但必须使用一种功能良好且对其抗原高度敏感的一抗。这同时也是一个缺点，因为荧光耦合和验证的一抗成本较为高昂。此外，每个靶向结构都需要一个单独的一抗，与间接IF相比，抗体与直接IF中的荧光色素的连接限制了设计实验的灵活性。
这种灵活性是间接IF的显著优势之一。通常在IF反应过程中，同一样本都会有几个不同的靶结构需要实现可视化观察，因此必须为每个靶向分子选择一个离散的荧光色素。
在间接IF中，不同的荧光耦合二抗可以与不同的一抗结合（当然还要考虑到物种的反应性）。相较之下，如果想在直接IF中对靶向结构“玩”颜色组合，则需要为每一种颜色使用单独的一抗。间接荧光的另一个优点是二抗的信号放大。多个二抗分子可与一个一抗结合来实现荧光增强，这意味可减少使用一抗。
间接IF的工作流程可能需要花费更多时间，但由于一抗和二抗能够组合而且整个操作过程的经济性更高，因此间接荧光成为了绝大多数研究人员的首选方法。
图2：有两种方法通过免疫荧光显示靶向结构：在两种变体中，一种特异的一抗用于识别靶分子上的特定表位。在此图中，目标分子由几个相同的蛋白质亚单位（=大分子）组成，因此会在每个亚单位上表现出几个相同类型的表位。为方便简化，此处只描绘了一个表位。
直接IF中，一抗直接连接到荧光色素，在显微镜下观察靶向结构。
间接IF中，荧光耦合二抗在第二培育步骤中使用，从而专门对一抗进行标记。因为多个二抗分子可以结合到一个一抗上，所以选择抗体和荧光色素的灵活性更大，并能够进一步放大信号。
抗体与荧光色素
高质量的IF染色当中，最重要的工具是良好的一抗。同时，几乎每种细胞类型中的每种蛋白质都有一种或几种市售抗体。但此处需要强调若干重要注意事项。
要根据IF染色来做出精确的科学或临床声明，就必须确保一抗对其目标抗原的特异性。在操作中，研究人员不应完全依赖商业供应商的说明。应根据之前的使用经验以及文献中确认有效的一抗来进行抗体选择。查看制造商网站上的抗体数据表，查看IF染色的可用图片并与自身期望相比较，或者与其他已发布的插图进行比较。注意抗体的克隆号，因为单克隆抗体只与一个表位特异性结合，而多克隆抗体可识别多个表位，因此有可能存在非靶向结构的非特异性标记。所以，特异性较高且性能较优的单克隆抗体通常更昂贵，但也能获得更好的效果。
如希望开展多色间接IF实验，则不同的一抗必须衍生自不同的物种，以便在之后通过荧光耦合二抗来区分免疫复合体（见表1）。比如，您希望使用小鼠衍生的抗体抗蛋白A、兔衍生的抗体抗蛋白B和大鼠衍生的抗体抗蛋白C来实施IF检查。在选择二抗时必须记住，每种抗体都只能特定识别一种一抗。此外，在这三种二抗的例子中，荧光色素的波长光谱必须不同，以便在显微镜分析中辨别荧光信号。如今，可以买到与荧光色素相连的二抗，其波长范围从紫外线到红外线，几乎可以针对任何物种的一抗。因此，研究人员目前仅受到现有显微镜（滤光片组、激发激光器）配置的限制。利用新型的激光器，可以扩展红外一区的信号（图一、二）。
靶向蛋白质 | 蛋白质 A | 蛋白质 B | 蛋白质 C |
靶向物种 | 人类 | 人类 | 人类 |
一抗 | 抗蛋白 A | 抗蛋白 B | 抗蛋白 C |
一抗物种 反应性 | 小鼠抗人 | 兔抗人 | 大鼠抗人 |
二抗物种 反应性 | 羊抗小鼠 | 羊抗兔 | 羊抗大鼠 |
荧光色素 激发/发射 | 490/525 nm | 556/573 nm | 650/665 nm |
表1：此处的多色间接IF示例演示了如何在同一个细胞中同时标记三种不同的蛋白质。三种蛋白质的一抗必须来自不同的物种，以便用三种不同的荧光色素耦合二抗来进行检测。二抗的荧光色素必须在波长光谱上有所区分才能在显微镜下进行不同的分析。
图一 常见荧光蛋白和荧光素的发射光谱
图二 在近红外一区，利用新型荧光标记可以获得更多信号。Cos-7细胞图像，使用SiR-Actin（657 – 740nm探测范围）、AF750-Tom20（760 – 790nm）、AF790-Tubulin（810 – 850nm）标记。样本由苏黎世大学的Jana Döhner和Urs Ziegler提供。左：使用传统的GaAsP探测器。右：使用STELLARIS 8。
了解了借助免疫荧光方法观察细胞的原理，接下来获得目标样本并根据实验设计合理制备用于荧光观察的样片。下一期将为您介绍如何为免疫荧光显微镜制备样本。
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