红外双（多）光子显微镜：

亚细胞水平的深层组织成像

Volker Andresen1,2, Stephanie Alexander1, Wolfgang-Moritz Heupel1, Markus Hirschberg1, Robert M Hoffman3 and Peter Friedl1,4

Current Opinion in Biotechnology 2009, 20:1–9

    多光子显微镜是一种在深层（厚）组织切片或者器官中观察细胞和细胞功能的一种方法选择。这里我们介绍一种使用激发光波长大约为1080nm的红外MPM IR-MPM的结构和应用。相比于传统MPM，IR-MPM可以使用红色荧光团和荧光蛋白标记，成像深度加倍，改善了组织结构的二次谐波产生，大大降低了光毒性和光漂白。而且，它可以在几百微米深度提供亚细胞分辨率的成像，因此强化了活细胞的长时间成像和深层组织成像功能。

导论

    MPM（多光子显微镜）是一种用于活体或活细胞研究的重要测量技术，可应用于神经科学，免疫学和肿瘤研究。MPM的相对于其它成像方法的主要优势是它具备在活动物器官或组织内观察细胞运动，细胞-细胞间相互作用，和细胞内信号传递的能力。与激光共聚焦相比，MPM将成像深度大幅提升，从几十um到深达1mm在某种组织类型中，如大脑。相对激光共聚焦，更多的优点在于其内在的亚微米水平的空间分辨率可以允许揭示亚细胞水平的细节和精细的组织结构；由于激发光的长波长，降低了散射和吸收，并显著降低了离焦位置的光漂白和光毒性。而且，MPM能够进行内生荧光团的特征性紫外吸收波段激发和各向异性生物结构，如具有了大的超级化率的胶原蛋白和骨骼肌纤维的二次谐波发生SHG。

    除了这些优点外，多光子激发也具有显著地局限性：在光学致密样品，如包含结缔组织和细胞丰富组织中的穿透深度仍然不够，皮肤、淋巴结、肌肉、肾脏、和肿瘤；由于光的散射和光束轮廓的失真会导致成像深度增加的同时降低成像的空间分辨率；对敏感的细胞功能的光致毒性；对红色和近红外荧光团的激发不足。后者尤其重要，因为许多红移荧光团已经成为透过皮肤检测活动物深层组织病变的标准传感器，包括整个身体成像。一个补偿荧光团激发不足的通用方法是将激光能量增强到高于无毒害水平。但是，一旦超过一个特定的激光水平，激光能量增加带来的非线性光损伤增加速度快于激发光子数目的增加速度。因此强烈地增加了对敏感细胞和组织功能的光毒性伤害，如细胞分裂和信号传导。

    为了克服NIRMPM现存的某些缺点，尤其是限制的组织穿透深度，光诱导的细胞损伤，和红色荧光团的不良激发，此处我们描述了IR-MPM的结构和在活细胞和皮肤内深层组织成像、淋巴结和肿瘤损伤等方面生命科学的应用。

红外激发的MPM：系统设计

    通过使用一个光学参量震荡器OPO作为红外多光子光源，我们将多光子和二次谐波发生SHG显微成像推向红光波段。一方面，一个高重复率短脉冲的Ti：Sa激光器(Chemeleon XR, Coherent)产生710 to 980 nm的激光用于直接激发。另一方面，它作为一个基于非临界相位匹配交互作用的周期性极化晶体内的OPO(PP Automatic, APE)的泵浦光源 (Figure 1a). 光学参量震荡是一个将短波长光束转化为两个长波长可调谐光束（信号光束和空闲光束）的非线性过程。对于一个 775 或 830 nm的泵浦波长，OPO信号光束光谱范围为 1060 到 1450 nm.

    两束光都通过光束整形装置来控制它们的直径、准直、脉冲长度和能量，之后进入一个优化的可同时使用Ti：Sa和OPO激光的扫描头(TriM Scope, LaVision BioTec)。光束通过一个双色镜被单轴混合，之后共同被一对检流计扫描头反射。所用物镜(20 X IR,NA 0.95; Olympus)具有一个2mm长的工作距离可用于穿透深层组织，它被镀膜且对从430nm到1450nm的一个宽波长范围进行了修正。