在共聚焦显微镜中，测定共定位的能力受限于光学系统的分辨率及用于照明样品的入射光波长。宽场荧光和共聚焦显微镜理论分辨率约为 200nm，但在实际上，由于各种原因这个数降到 400nm 和 600nm 之间，原因包括显微镜光路未完全对准、光学折射率波动、光学像差及样品制备的不合适。然而，对于一个已经完全调好的共聚焦显微镜来说，两个荧光分子是否连接到同一个目标对象上，或者它们是否定位在同一个器官上受光学分辨率影响。共定位的许多实验是围绕高特异性的合成探针和抗体进行的，标记目标是容易区分的局部的、明确的细胞结构。