各种基于图像的中心位置估计(称为质心拟合)方法，如二维高斯拟合方法，在单分子定位显微镜(SMLM)中已被广泛用于精确确定每个荧光团的位置。然而，如何将单分子横向定位精度提高到分子尺度(< 2 nm)来实现高通量纳米结构成像仍然是一个挑战。

图片来源：WANG Guoyan Wang and OU Nanjun

　　中国科学院生物物理研究所的徐涛教授和纪伟教授在Nature Methods上发表了一项研究，他们开发了一种新的干涉单分子定位显微镜技术，利用了快速调制的结构光照，称为重复光学选择性曝光(Repetitive Optical Selective Exposure，ROSE)。

　　ROSE利用六种不同方向和相位干涉条纹来激发荧光分子。荧光分子的强度与干涉条纹的相位密切相关。荧光分子的定位是通过干涉条纹的多个激发模式的强度，提供了大约两倍的定位精度的提高。该技术将单分子定位显微镜(SMLM)的分辨率提高到小于3 nm (~1 nm定位精度)。

　　为了验证ROSE的性能，研究人员首先设计了5-、10-和20-nm点对点间距的DNA折纸结构的三种不同网格。传统的质心拟合和ROSE都可以在相同的光子预算下求解20nm结构。ROSE也可以清晰地分辨出10nm的距离，这是质心拟合无法解决的。

　　研究人员表明， ROSE可以以3纳米的分辨率解决25 * 25μm2的大视场中5 nm的结构，这意味着ROSE有能力推动提高SMLM分子规模的分辨能力。

　　此外，利用ROSE分析细胞纳米结构，研究人员发现，ROSE在解决单个微管长丝的中空结构、小网格蛋白包被凹坑(CCPs)和肌动蛋白长丝的细胞纳米结构方面具有优势。傅里叶环相关(FRC)分析表明，与质心拟合方法相比，ROSE提高了两倍的最终分辨率。

　　通过引入沿轴向的附加激发模式，ROSE可以扩展到三维纳米尺度成像。该方法有望在分子水平上拓展SMLM在生物大分子动力学分析和结构研究中的应用。