哺乳动物细胞培养系统可以根据几种不同的特征进行细分。上一期我们介绍了其最显著的分类特征——形态，而另一个区别就是细胞类型。根据其来源，细胞可以细分为永生化细胞，原代细胞和干细胞（包括患者特异性细胞）。

哺乳动物细胞培养入门之形态学篇

细胞类型

永生化细胞

使用中最常见的细胞类型可以追溯到永生化细胞，这些细胞要么来源于肿瘤组织，要么已被癌基因转染。由于其恶性背景，它们会无限分裂。这以特性使它们非常适合作为细胞系进行培养，而且功能强大且价格适中。

另一方面，应该考虑到它们的突变遗传背景不再与生理条件非常接近。一个非常突出的例子是源自宫颈癌的HeLa细胞系。与正常人细胞的46条染色体相比，它们的细胞核大约有80条染色体。其他常用的永生化细胞系是HEK，A549，Jurkat，MDCK，COS或Vero细胞。

图1 HeLa细胞属于永生细胞系

原代细胞

原代细胞直接取自活体组织。为了培养，将原始组织片段通过酶、化学或机械方法解离为单个细胞，然后将其接种到培养瓶中。原代细胞比永生细胞系更难培养，他们的生存率很低，而且许多没有分裂。此外，它们的基因操作可能具有挑战性。尽管如此，还是值得付出努力的，因为它们的特性更接近自然细胞。换句话说，用原代细胞获得的实验结果可以更有信心地转化到体内。

图2 原代神经元细胞培养

干细胞

干细胞是人体的原始细胞。它们可以从非专能细胞分化为具有专用特征和功能的专用组织细胞。因此，它们可以分为几类。多能干细胞（pluripotent stem cells）是用途最广泛的干细胞，能够分化为任何种类的人体细胞。与多能干细胞相比，专能干细胞（multipotent stem cells）显示出有限的分化范围。双能干细胞只能发育成两种不同的细胞类型。干细胞除了分化成特殊的细胞类型外，还可以自我更新。

干细胞的来源各不相同。通常，它们可以从胚胎中获得，比如胚胎干细胞，也可以从某些组织中提取，例如骨髓中含有的造血干细胞。这些类型的细胞称为“组织特异性”或“成体”干细胞。出于伦理考虑，很难从活体动物或人身上获得干细胞，这也是为什么诱导已分化的人体细胞转化为干细胞会引起科学家们的广泛兴趣。仅用四个基因（c-Myc，klf-4，oct-4，sox-2）转染即可诱导体细胞进入重编程，从而产生所谓的诱导性多能干细胞（iPSC）。

尽管干细胞研究充满挑战性，但它们为研究人员提供了最大的灵活性。根据细胞培养基中所含的成分（如某些营养素和生长因子），可以诱导干细胞分化为不同的细胞类型，例如神经元。

尤其是在临床环境中，iPSC非常重要，因为研究人员能够通过获得疾病特异性甚至患者特异性细胞来寻找治疗方法，这种个体化治疗有望带来非常好的治疗效果。

上面提到的所有细胞类型都拥有不同的生长方式。例如，一次细胞培养可以仅由单个细胞类型或多种细胞类型组成，并且可以进行2D或3D培养。

培养细胞的最简单方法是在普通培养皿中，单层细胞在底部生长，这种培养方式简单又便宜。因此，几乎在每个细胞实验室中都可以找到在经典培养基上培养的HeLa、MDCK、HEK细胞等。

图3 2D单一类型细胞培养

另一方面，2D单培养也是维持细胞生长最人工的方式，主要原因有两个：细胞在生物体中呈3D生长，而且它们并不会与其他类型细胞分开生长。

最接近生理状态的是将几种细胞类型的2D共培养，典型的共培养细胞系是神经元原代培养，即神经胶质细胞与神经元一起生长。

图4 2D多类型细胞培养

想要进入3D世界，细胞生物学家必须运用某些技巧。其中之一是消除细胞粘附在培养基上的机会，可以通过使用带有特殊涂层的细胞培养容器、使用凝胶培养基（例如Matrigel™），或通过“悬滴”培养细胞来实现。简而言之，如果细胞不能粘附在培养皿上，它们就会彼此粘附。最终，数千个单细胞粘附形成直径为200~1000 µm的球状体。这种物体更接近更真实组织，包括天然组织中常见的代谢和增殖梯度。这也是球状体通常被用于药物开发的原因之一，因为它们精确地模拟了血管肿瘤。

图5 3D单类型细胞培养

在更逼真的3D细胞培养的另一种方法是使用支架。可以利用由金属，聚合物或陶瓷制成的培养基来帮助细胞蠕变成三维形。这些支架可以用作临床植入，也可应用于实验室。

基于类似的原理也可以在器官芯片中实现，该芯片由被各种细胞类型定殖的微流体装置组成。微流体装置具有可以连续灌注的多个腔室，通过这种设设计，研究人员可以在组织和器官水平上模拟生理学。使用膜和可伸缩材料的可以模拟出与生理结构类似的人造结构，例如模拟呼吸或转移等动态过程。

另一个非常真实的细胞培养组织是基于在细胞外基质凝胶内部存在不同生长因子的情况下培养的干细胞。根据生长因子的类型（eg：FGF，EGF等）和其他组分，干细胞会发育成称为类器官的微型器官。它们非常类似于“长大的”对应物，并显示出器官典型的发育和特定器官的功能。因此，脑，胃，肝，肠等类器官可用于研究疾病和器官发育或进行药物筛选和毒理学研究。

图6 3D单类型细胞培养

生长条件

哺乳动物细胞培养必须保持在37°C，通常在具有各种形状和大小的专用一次性塑料容器中进行培养。

图7 通常用于哺乳动物细胞培养的容器

其中最小的是96孔板，通常用于筛选应用。

图8 专用的固定框架

另一方面，有一些细胞工厂被用于大规模生产疫苗或蛋白质。

图9 细胞工厂

与细胞培养物一起工作意味着在无菌条件下操作，例如在超净工作台上并使用抗生素。而且，必须向提供包含营养物和生长因子的适宜培养基，包括：葡萄糖、丙酮酸钠、氨基酸、维生素、无机盐、水、由于其不稳定性，因此经常添加氨基酸谷氨酰胺。蛋白质，脂质或生长因子通常添加在胎牛血清中补充。

细胞的代谢产物使培养基酸化。因此，缓冲液系统可用于维持pH稳定（〜7.4）。通常通过酚红指示剂监测pH，并使用碳酸氢盐（HCO3-）缓冲液，它们结合H+的能力取决于周围的CO2水平。因此，通常向细胞培养箱提供CO2。HEPES缓冲液独立于CO2，通常用于无法进行CO2孵育的活细胞显微镜应用中。

显微镜

说到用于细胞培养的显微镜，其必须具备某些基本特征。哺乳动物细胞在液体培养基中培养就意味着显微镜必须具有倒置配置。在这种配置中，物镜安装在培养皿下方，培养皿放置在显微镜载物台上，聚光镜安装在上方。只有通过这种设置，物镜才能足够接近样品。此外，通过这种构造，研究人员在样品周围具有更多的自由空间。

想要大致了解细胞培养的总体状况，放大倍率为100x~200x足矣。哺乳动物细胞固有的低对比度要求显微镜提供特定的对比度方法。相差和调制相差是最常见的，而微分干涉（DIC）与通常用于细胞培养的塑料容器不兼容。

图10 细胞融合度 左→右依次：15%、60%、100%

借助这种基本设备，研究人员可以判断细胞数量和融合度。根据融合情况，将细胞传代培养至其他容器中。