上海显微镜厂

上海显微镜厂家
首页 > 技术资料 > 超分辨率显微镜分析在荧光抗体筛选的应用

超分辨率显微镜分析在荧光抗体筛选的应用

2021-03-01 | 来源:
1873年,德国医师ErnstAbbe提出了“衍射极限”的概念。他预测,由于光的基本衍射性质,光学显微镜无法实现200nm以下的分辨率。实际上,当两个相隔很近的物点同时发光时,得到的图像是模糊的,无法分辨。超分辨率显微镜(SRM)的诞生打破了一个世纪多以来一直被认为无法突破的瓶颈。如今,科学家们已经研发了多种超分辨率技术,远远超出了衍射极限,能够观察到分子尺度的细节。SRM技术可以将细胞结构解析为亚细胞水平,从而获取有关细胞组分的3D结

1873年,德国医师Ernst Abbe 提出了“衍射极限”的概念。他预测,由于光的基本衍射性质,光学显微镜无法实现200nm以下的分辨率。实际上,当两个相隔很近的物点同时发光时,得到的图像是模糊的,无法分辨。超分辨率显微镜(SRM)的诞生打破了一个世纪多以来一直被认为无法突破的瓶颈。

 

如今,科学家们已经研发了多种超分辨率技术,远远超出了衍射极限,能够观察到分子尺度的细节。SRM技术可以将细胞结构解析为亚细胞水平,从而获取有关细胞组分的3D结构的信息,并可以观察到单分子共定位。

 

下面我们来简要概述了时下几种最流行的SRM技术的原理:

 

 

1.受激发射耗竭(STED)显微镜

 

STED对于有经验的荧光显微镜使用者来说相对简单,该方法和普通共聚焦显微镜(Confocal)的原理相同。普通Confocal使用单光源,而STED使用双光源。其中一个光源发射能激发荧光团——荧光标签(研究者们以此来定位和观察蛋白)的光,另一个光源发出不同波长的光,用于抑制荧光。这束光是环形的,并且与第一束光有所重叠,因此只有环形中间区域的分子会继续发出荧光。

 

获得STED超分辨率图片并没有那么复杂,用户需要仔细调整参数,才能得到漂亮的结果,否则所得图片和普通confocal没有差别。

 

使用传统和RESCue受激发射减损显微镜(STED)得到的细胞核膜上核孔复合体的图片。

 

STED的原理:

 

显微镜透镜对光的衍射会导致来自单个点的光出现在较大的区域,这称为点扩散函数(PSF)(见图1),由于PSF的存在,使得常规显微镜无法达到超分辨。

 

 

图1:在普通光学显微镜中,成像是通过将来自点光源的光线会聚到像平面上的单个点来实现的。超出光衍射的限制,防止了射线的精确会聚,从而导致物体的图像模糊。显微镜的分辨率取决于点扩散函数(PSF)的大小,或对象在某个点的三维强度分布。在STED中,应用环形炸弹耗尽型激光器,其零点与激发激光焦点的最大值重叠。STED激光器引起荧光的“饱和耗尽”,从而“抑制了来自零点附近区域的荧光,导致有效PSF的尺寸减小”。

 

而受激发射耗竭(STED)显微镜通过限制样品的荧光区域(PSF)产生超分辨率图像。STED显微镜使用两个重叠的激光,第一个按照常规显微镜激发荧光团(图2A)。第二个激光器称为耗尽激光器(STED激光器),它激发“甜甜圈”形状的激光,其中心的零强度点非常小(〜30 nm)(未激发)。除了在甜甜圈的中心处之外,第二激光起到了“关闭”第一激光所产生的外圈荧光,从而将样本激发的荧光分子范围缩小到中心圆点处,这有效地降低了PSF,以产生非常小的单分子荧光聚焦区域,从而获得高分辨率图像(图2D)。

 

图2:

 

单个小于250 nm的蛋白质无法通过标准共聚焦成像解析,从而导致图像模糊

STED耗尽激光器产生了淬灭外围荧光的“甜甜圈”

饱和耗尽在功能上降低了激励PSF

随之可以解析单个蛋白质

 

适用于STED的荧光团偶联抗体:

 

为了获得超分辨率,染料必须具有STED激光波长的高发射截面,并有效地实现高饱和度。这种强烈的照明确保了所有被STED激光“关闭”的分子都受受激发射的支配。合适的染料应具有低的光漂白性,具有高的量子产率和对比度,并在目标附近具有足够的标记密度。

 

Jackson提供荧光染料标记的二抗,下列染料标记的二抗已被验证在STED中成功使用: AlexaFluor®488(如:115-545-003),FITC(如:715-095-150),AlexaFluor®594(如:715-585-151)和AlexaFluor®647。

 

2. 随机光学重建显微镜(STORM)

 

最有名的“基于探针”的技术是Betzig等人研发的光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy, PALM)和哈佛大学庄小威实验室发明的随机光学重建显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。最初所有的荧光标签都是暗的。然后使用激光脉冲来激活一小部分荧光标签,随后使用另一束光来关闭这些荧光标签。不断重复这个过程,生成一系列部分荧光图,最后重建成整个视野的荧光图。,以产生分辨率优于常规方法收集的图像。

 

使用超分辨率随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM),科学家首次观察到了神经元轴突的细胞骨架。

 

Jackson提供适用于dSTORM应用的标记二抗,简而言之,较低强度的激发光激发样品,随机激活少量染料分子。单个发荧光的染料分子足够分散,因此可以计算其点扩散函数的中心,从而推断出染料的确切位置。然后使用第二激光关闭所有分子,并重复该过程。然后,通过重叠每种染料的所有映射点扩展函数,以数学方式生成高分辨率图像。

 

用于单分子定位实验的荧光团偶联抗体 

用于单分子定位的最佳染料通常非常亮,并产生足够的光子以可靠地产生紧密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多种广谱范围内的可靠染料,例如AlexaFluor®488,AlexaFluor®647和Cy™5,可用于这些类型的实验。

 

建议用于超分辨率显微镜的荧光染料偶联物:

 

STED 激发波长(nm) 发射波长(nm)
Alexa Fluor® 488 493 519
荧光素 / FITC 492 520
Alexa Fluor® 594 591 614
Alexa Fluor® 647 651 667

 

STORM 激发波长(nm) 发射波长(nm)
Alexa Fluor® 488 493 519
Alexa Fluor® 647 651 667
Cy™5 650 670

 

每种SRM技术都有各自的探针选择要求,Jackson ImmunoResearch提供多种已知在SRM应用中表现良好的荧光标记二抗。应该注意的是,SRM领域变化迅速,因此,建议从专业技术文献中寻求信息,以帮助选择合适的荧光团。

 

责任编辑:    本文来源:

相关文章阅读

  • 超声显微镜
    超声显微镜超声显微镜,ultrasonic microscope,利用样品声学性能的差别,用声成像的方法来生成高反差、高放大倍率的超声像的装置。

    类型:功能用途 2022-01-10 2080

  • 体视显微镜的用途、特点、结构
    作为动物学、植物学、昆虫学、组织学、矿物学、考古学、地质学和皮肤病学等的研究和解剖工具。

    类型:结构原理 2021-11-29 1440

  • 光学镜片的工作原理
    显微镜镜片一般称作光学镜片.它是利用不同形状(凹、凸、平面)的镜片之聚、散、滤光的光学原理

    类型:结构原理 2021-11-10 2170

  • 显微镜的工作原理
    光线在均匀的各向同性介质中,两点之间以直线传播,当通过不同密度介质的透明物体时,则发生折射现象,这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的

    类型:结构原理 2021-11-10 1430

相关产品
  • XTL-800系列高清体视显微镜
  • 体视电子显微镜电视型 XTL-100
    行业应用解决方案仪器回答新闻资讯联系我们公司简介搜索词语行业词组售后服务免责声明资质证书商务合作访客建议
    地址:上海市浦东大道2440号5楼 电话:68610355 400-6263-599 传真:021-50353995 邮箱:sales@xianweijing.com
    Copyright 2004-2021 xianweijing.com All Rights Reserved. 沪ICP备05004570号 沪公网安备31011502009251号 访问统计:200000 支持:仪器网yiqi.com 管理入口