光圈。光圈开得大，顾名思义所有光信号包括背景信号都会增强。

曝光时间。光信号再强，你只选取其中很少一部分来成像，也能够控制图像中的信号强度。

样品/玻片本身的自发荧光。

样品的非特异性染色。

总体是一个所有检测手段中共通的问题，即信噪比，信号与噪声比率。

1，2对信噪比影响不大，在背景过强时很难通过调整1，2来解决问题。如果背景不存在过强问题，则通过1确保有用信号足够强，通过2减低曝光时间至背景充分黑暗即可。

3，4才是控制信噪比的关键因素。自发荧光无法完全避免，只能通过选取自发荧光较低的材料来控制，另外固定及染色过程中的一些试剂有可能影响样本的自发荧光。非特异性染色是更为常见的造成背景问题的原因，通过优化封闭条件，抗体/试剂用量，染色时长与温度等条件来调整。