日本科学家的一项新研究将彻底改变荧光定量显微镜领域。

荧光显微镜在生物化学和生命科学中有着广泛的应用，因为它使科学家能够直接观察细胞及其周围的某些化合物。荧光分子吸收特定波长范围内的光，然后在较长的波长范围内重新发射。然而，传统荧光显微技术的主要局限性在于其结果很难定量评价，荧光强度受实验条件和荧光物质浓度的影响很大。现在，日本科学家的一项新研究将彻底改变荧光定量显微镜领域。

解决这个历史遗留问题的一种方法是关注荧光寿命而不是强度。当一种荧光物质被短时间的光照射时，产生的荧光不会立即消失，而是以该物质特有的方式随时间“衰减”。“荧光寿命显微镜（fluorescence lifetime microscopy）”技术利用这种现象——这与实验条件无关——精确地量化荧光分子及其环境中的变化。然而，荧光衰减非常快，普通相机无法捕捉到它。虽然可以使用单点光电探测器，但它必须扫描整个样品区域，以便能够从每个测量点重建完整的2D图片。这个过程涉及到机械部件的运动，这大大限制了图像捕获的速度。

不要紧，在最近发表在《Science Advances》上的这项研究中，日本科学家团队开发了一种新的方法来获取荧光寿命图像，而无需机械扫描。领导这项研究的德岛大学pLED研究所的Takeshi Yasui教授解释说：“我们的方法可以被解释为在二维空间上同时绘制44400个‘光秒表’来测量荧光寿命——所有这些都是在一次拍摄和不扫描的情况下完成的。”

那么，这是如何实现的呢？

他们方法的主要支柱之一是使用光学频率梳作为样品的激发光。它们之间的光频率之和基本上是由一个离散的光频率之和组成的。在这种情况下，“梳子”一词指的是信号在与光频率对应时的外观：从光频率轴升起的密集的等距离“尖峰”簇，类似于梳子。利用一对特殊的光拍信号对光拍进行频率调制，将每一对光拍信号用不同的光拍频率进行调制。这里的关键是，每个光束在空间上不同的位置击中样品，在样品（像素）的2D表面上的每个点和双梳光拍的每个调制频率之间创建一对一的对应关系。

由于其荧光特性，样品重新发射部分捕获的辐射，同时仍保持上述频率-位置对应关系。然后用透镜将样品发出的荧光聚焦到高速单点光电探测器上。最后，被测信号被数学地转换到频域，并且每个“像素”处的荧光寿命可以容易地从存在于该调制频率处的激发信号与被测信号之间的相对相位延迟来计算。

由于其优越的速度和高空间分辨率，本研究开发的显微镜方法将更容易利用荧光寿命测量的优势。“因为我们的技术不需要扫描，所以每次拍摄都能保证对整个样本进行同步测量，”Yasui教授说。“这将有助于需要动态观察活细胞的生命科学。”这种新的方法可以用于同时成像多个样本进行抗原检测，这已经被用于诊断COVID-19。

也许最重要的是，这项研究展示了光学频率梳（过去仅仅被用作频率尺）如何在显微镜技术中找到一席之地，推动生命科学的发展。它有希望开发新的治疗方法来治疗顽固性疾病和提高预期寿命，从而造福全人类。

参考文献

Full-field fluorescence lifetime dual-comb microscopy using spectral mapping and frequency multiplexing of dual-comb optical beats