五、激光扫描共焦显微镜技术的应用定位、定量三维重组动态测量¨ 活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量¨ 活细胞内H+浓度（ pH值）的测量¨ 自由基的检测¨ 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 应用：细胞膜电位的测量      荧光漂白恢复（FRAP）的测量      笼锁解笼锁的测量      荧光能量共振转移（FRET）的测量      其他应用1、定位、定量免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量。如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI末端原位杂交-fitc + PI荧光原位杂交： 染色体基因定位单细胞凝胶电泳GFP的表达游离Ca2+ 的分布与定量定位、定量研究中常用荧光探针1）Amine-Reactive Probes与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等2）FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/5123）异硫氰基荧光素 494/5184）TRITC 四甲基异硫氰基罗丹明 544/572 BODIPY TMR 543/5695）Texas Red 德州红 595/615 BODIPY TR592/6186）PE 藻红蛋白 565/578 7）cy3 490/5308）cy5 650/690

(1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白   免役荧光标记： 与抗体耦联,    直标: 一抗+荧光探针   间标: 二抗+荧光探针  如: 微管蛋白 抗 tublin抗体+荧光探针  肌动蛋白 Palloidine+荧光探针(2)细胞膜表面受体   配体+荧光探针  如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)   标记 Gm1: 霍乱毒素受体  霍乱毒素+FITC

2.标记细胞器荧光探针(1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子性,可检测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留时间短   JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光   线粒体膜电位低时为多聚体 490/590 发红光   可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电   位最佳探针: Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 ,   稳定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 还原型, 只能染活细胞 (2)溶酶体 Lysosome中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官为非特异性   AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活细胞  LysoTracker Blue  LysoTracker Red(3)内质网 Endoplasmic Reticulum   DiOC6 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体(4)高尔基体 Golgi apparatus  NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞 ¨细胞器的单克隆抗体(5)细胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死细胞  碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞  Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活细胞  Hochest 33258 (同上)  DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞  Chromomycin A3 450/470 DNA G-C  AO 500/526 DNA 活细胞  460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA   死细胞  SYTO 活细胞3. GFP 绿色荧光蛋白GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光 。将外源基因与GFP DNA 相连, GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察如: 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程:定位与定量测量应注意的问题定位：1.可以对图像进行修饰，      2.pinhole 可尽可能的小。      3.确认共定位时要取两个通道荧光相互干扰的对照图像定量：      1.仪器的各个条件必须一致      2.必须用原始图像进行定量测量      3.Pinhole尽可能的大六.显微CT与三维重组光切的层数：VoxelsizeZ £ 2VoxelsizeX七.动态测量 Physiology:细胞内离子动态变化测量1).游离Ca2+测量    检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100n M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）             荧光探针                           激发波长          发射波长 Kd            FLuo3-AM, K+,                    dextran 506nm       525nm 390nM               Fluo4                              506nm               525nm                 Calcium Green-1 507nm              530nm               190nM            Calcium Green-2 507nm              535nm               550nM            Fura red   420/480nm               637nm               140nM            Oregon Green 488  494nm            520nm               20,000nM            Calcium Crimson   583nm            602nm                328nM            Indo-1   356nm                    405/458nm             230nM            Fura-2     340/380                 476nm                145nM相对 测量                              DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)            Ca2+浓度绝对测量单波长公式法            Fluo3: 530nm Kd=450nM            [Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)            Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2)            Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)            测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40）            细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）            细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）            标准曲线法：根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA- Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度            比例荧光的测量：双波长(比例荧光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2细胞器的Ca2+测量            1.线粒体内游离Ca2+测量  Fluo-3 + TMRM(线粒体荧光探针，红色）            2. 特异定位的重组水母发光蛋白  水母发光蛋白与 Ca2+结合后发蓝光  用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化 目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测 细胞内游离Ca2+测量的应用：钙的特性            1．细胞内外的电化学梯度103-104倍            2．细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致胞内钙明显升高            3．细胞内钙为细胞激活“开关”细胞内钙的生理作用            1．肌肉的兴奋收缩-收缩偶联            2．神经递质的释放            3．学习记忆的增强            4．卵子受精            5．细胞分裂和再生            6．细胞调亡            7．细胞间通讯            8．细胞信号传导            9. DNA合成            10. 基因表达细胞内钙超载与疾病            1．高血压、脑缺血、心脏病、内分泌病—胞内钙浓度异常            2．糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化病—胞内钙浓度增高            3．人体缺钙—骨钙大量丢失，神经细胞的钙浓度增高            4．老化和老年性痴呆-神经细胞内钙浓度增高 细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M），细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）八.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching)定义:经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的激光照射后,荧光物质的光化学结构被迫坏,荧光强度下降, 且为不可逆的过程, 但此处荧光强度会渐渐恢复, 荧光强度和恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散的速率, 或分子运动速度。            R=(I2-I1 /I0-I2)100%            R-荧光漂白恢复率：代表分子的运动速度应用：细胞间通讯， 细胞膜流动性，蛋白分子的运动九.笼锁解笼锁的测量定义：笼锁化合物全称为光致不稳定笼锁化合物，为人工合成的用隐蔽基团修饰生物活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，两者间的共价键几解离而释放出活性分子，这一光解作用称为解笼锁。 笼锁化合物的种类：笼锁的神经递质、笼锁的第二信使、笼锁钙等十．荧光能量共振转移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。能量共振转移：分子可以看作为正负电荷分离的一个偶极子，受激发以一定的频率振动，如果其附近有一个振动频率相同的另一分子存在，则通过这两个分子之间的偶极-偶极相互作用，能量可以非辐射方式从前者转移到后者，这种能量转移称为共振转移。荧光能量共振转移的条件两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2供体与受体的距离在2-7nm，供体的发射波长与受体的激发波长一致检测：     以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。应用：检测大分子的相互作用大分子构象的改变(蛋白)，例：大分子(亚基)的结合与分离受体与配体的结合 ，常用荧光探剂：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP   十一 .其它应用生物材料,例: 细胞在生物材料中的生长状态及分布激光扫描共焦显微镜的发展趋势：                             连续光谱型Confocal                             多光子激光扫描显微镜