生物组织的高分辨率3D荧光成像在亚细胞、细胞和组织水平上为基因表达、细胞形态和细胞在组织中的分布研究搭建了桥梁。组织透明化方法将生物组织透明，并结合最新的3D荧光成像技术实现了组织结构可视化。

尽管这种结合有诸多好处，但在3D组织成像应用中仍存在挑战：(1)在对厘米级样本进行微米级或更高分辨率成像时，传统光片显微镜成像效率不高；(2)传统光片显微镜难以兼容所有的组织透明化方法透明的样本；(3)不能实时校正由不同成像液的折射率变化引起的偏差，优化不同样品的成像性能；（4）显微镜仪器校准程序复杂且较为困难。

2020年11月3日，西湖大学高亮实验室团队在Cell Reports上发表文章A Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Imaging of Cleared Tissues，介绍了一款具有半自动校准能力的多功能平铺光片显微镜，它能够对所有组织透明化方法透明的样本组织进行多色快速3D成像，并且成像的空间分辨率达微米级（4×4×10μm3）甚至亚微米级（0.3×0.3×1μm3）。另外，通过组织膨胀技术，平铺光片显微镜的分辨能力可提高至小于100nm（70×70×200 nm3）。

文章指出，平铺光片技术很好地解决了上述问题。不同于其他的光片显微镜，平铺光片显微镜不仅在透明化大组织样本的3D成像上呈现更好的效果，而且可以大范围内更加简单的优化和调节成像品质，可以更方便的应用在不同领域。

那么，与其他的光片显微镜相比，平铺光片显微镜有哪些优点呢？

1） 和传统的光片显微镜相比，相同的成像时间里，采用平铺光片显微镜成像样本可提高空间分辨率以及成像效率。

2）通过变换不同NA的检测物镜，放大倍数，以及调整激发光片，平铺光片显微镜可以实现对厘米级的组织样本进行从微米级到亚微米级空间分辨率的成像，而利用组织膨胀技术可以进一步提高成像分辨率。

3）通过空间光调制器对激发光片进行相位调制，用于创建和优化样品照明的平铺光片。

4）显微镜具有半自动校准功能，保证了成像的准确性、可靠性和易用性；

5）显微镜与所有的组织透明化方法兼容，适用于不同形状，不同机械强度的组织成像。

6）不同的透明化组织样本可以在几分钟内快速更换成像；

7）可以对透明化组织进行多分辨率级别、各向同性、多色三维成像；

凭借上述优点，平铺光片显微镜对组织样本进行3D成像的结果又如何呢？

1）实现微米级空间分辨率的3D组织成像

具有近乎各向同性的微米级空间分辨率的3D组织成像非常适合在细胞水平上可视化组织结构。如图1所示，3小时内获取的小鼠脑血管网络展示了识别到的几乎所有的毛细血管。成像结果可对脑血管结构提供清晰的拓扑结构阐释。根据成像结果提取到的数据显示大脑皮层中这些穿透性的血管可通过毛细血管与位于胼胝体区域的海马内小静脉或小动脉相连接。因此，平铺光片显微镜卓越的3D成像能力可以辅助了解整脑不同脑区的血管网络分布。

图1 不同透明化方法的小鼠器官在微米级空间分辨率下的三维成像

2）多色3D组织成像能力

多色3D成像技术对研究组织内部不同细胞器的相对分布有极大帮助。平铺光片显微镜具有对所有波段的激发光进行相位调制的功能，可以确保不同激发光束共线校正，从而确保不同颜色通道采集图像的精确配准。本文通过双色标记的小鼠乳腺成像来检测显微镜的多色3D成像能力。图2（A-Y）小鼠乳腺双色成像结果表明可以清晰分辨位于乳腺管内层的腔细胞，及乳腺管外层的基底细胞。这两者的相对表达体现了乳腺导管和末端芽的不同分布模式，结果表明了乳腺细胞组成的空间异质性。

图2（Z-GG）展示了对人类的乳腺癌组织和相邻的正常乳腺组织进行成像。从实验表达结果可以看出，肿瘤组织失去了原有腺泡结构仅有异常的管状结构，并显示出具有利于癌细胞浸润的密集血管脉络系统。该患者的淋巴结肿大并伴有可疑的浸润细胞，这与脉管系统异常的表征相符。该组实验表明组织透明化和高分辨率3D组织成像技术在病理学应用中的价值。

图2 多色3D组织成像

3）亚微米级空间分辨率的3D组织成像

   为观察亚细胞组织结构，将平铺光片显微镜的检测物镜提升至1.0NA，照明物镜提升至0.28NA，产生1um薄光片对样本进行成像。如图3所示，成像结果呈现出高倍显微镜具有很好的亚细胞神经元结构的分辨能力，我们可以观察到兴奋性锥体神经元、神经元轴突上清晰可辨的树突棘和单个神经元的形态。

图3 亚微米级空间分辨率的3D组织成像

4）组织膨胀的亚微米级空间分辨率的3D组织成像

组织膨胀技术提供了一种比显微镜更高的空间分辨率来分辨组织结构的解决方案。实验研究了平铺光片显微镜与组织膨胀技术结合的成像能力。Thy1-eGFP小鼠脑透明化使用组织膨大技术将样本各向同性扩大5倍，成像空间分辨率为2um×2um×5um，那么同等的空间分辨率根据5倍膨胀比例，映射到对实际样本的分辨能力是0.4um×0.4um×1um。成像结果如图4所示，小鼠大脑海马区细胞和亚细胞神经元结构清晰可见，尽管海马区细胞密度较高，依旧可以分解出单个神经元轴突和树突棘。同时，如图4虚线框内标识可以观察到一些神经轴突的神经间的轴浆运输。

图4 组织膨胀的亚微米级空间分辨率的3D组织成像

5) 采用组织膨胀技术实现100nm以下空间分辨率的3D组织成像

平铺光片显微镜通过采用更高NA的检测物镜和更薄的光片对膨胀组织成像，能够达到100nm以下的空间分辨率，从而实现对组织结构的进一步解析。

图5采用0.8NA的检测物镜以及更薄的激发光片展示了更精细的神经结构。研究结果表明，大脑神经网络极其复杂，纳米尺度空间分辨率的3D成像对完全解析大脑神经网络是非常必要的。

图5  100nm以下空间分辨率的3D组织成像

6) 实现多分辨率尺度的三维组织成像

 平铺光片显微镜的优势是可以为其他生物组织的研究提供帮助。图6展示了平铺光片显微镜对透明化的真涡虫以从微米到亚微米多种空间分辨率成像的结果。整体成像结果展示了干细胞在真涡虫内的整体分布，局部高空间分辨率成像结果展示了真涡虫内干细胞组织以及细胞与细胞之间的相互作用关系。因此，平铺光片显微镜可以更好地研究真涡虫干细胞的分布和功能。类似的优点同样适用于其他生物研究，例如秀丽隐杆线虫，黑腹果蝇，斑马鱼等。

图6  100nm以下空间分辨率的3D组织成像

结论

综上所述，本文开发了一款多功能平铺光片显微镜，具有卓越的多色3D成像能力，能够以微米级至100nm以下的空间分辨率对厘米级的透明化样本组织进行快速3D成像。该显微镜兼容所有的组织透明化方法，灵活适应不同的应用。它还具有通过相位调制实现半自动对准的能力，操作简单可靠。因此，平铺光片显微镜使得3D透明化组织成像在生物医学研究中更加可靠及可行。