摘要：全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术,它利用全内反射产生的隐失场来照明样品,从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。近年来，全内反射荧光显微术已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。本文简要介绍了全内反射荧光显微技术的基本知识及其在生物学方面的一些应用。 关键词：全内反射荧光显微术隐失波 生物单分子 引言：世界上第一台光学显微镜的产生，使人们能够观察到肉眼不能观察到的东西。经过几百年的发展，经过物理学家的不断努力，显微镜的性能不断提高，成像质量大为改进。许多新的光学显微镜也应运而生，如偏振光显微镜、相差显微镜、倒置显微镜等。但是，在细胞生物学方面传统光学显微镜始终不能解决生物样本显微中的几个重要问题：1.显微图像的信噪比不高2.光源对生物样本照射的损伤3.光学衍射所致的分辨极限（R ≥0. 61λ/nsinθ）。而这三个问题恰恰是生物单分子探测中亟待解决的问题。 20 世纪30 年代电子显微镜的发展导致了细胞研究的革命,使得生物学家得以从亚显微水平上认识细胞世界。进入80 年代,非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更是将成像的分辨率推进到纳米的精度。与此同时,新一代光学显微技术也应运而生，它们以其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性,再次成为生物学家、物理学家和成像学家们研究的热点。目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术,近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。这些技术在分子生物学、分子化学、激光医学及纳米材料等领域受到广泛关注,并产生了深远的影响。 全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术,它利用全内反射产生的隐失场来照明样品,从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大大提高。Hirsch field于1965年完成了第一个全内反射荧光实验,这是首次尝试用全内反射荧光法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合的TIR-FM技术是一种全新的突破.虽然它的具体应用还不到10年的时间,但是它在单分子探测中已显示出强大的生命力.1995年,Yanagida小组用TIRFM技术首次在液体溶液中得到了荧光标记的单个蛋白质分子的成像.1996年,Moerner小组又用这项技术实现了限制在丙烯酰胺胶体的纳米孔中的单分子的三维成像. 至今,全内反射荧光法在理论上和应用上均已得到较大发展,出现了多种全内反射荧光法,如时间分辨全内反射荧光、多重内反射荧光和全内反射荧光相关光谱等方法。全内反射荧光配合偏振技术和时间分辨技术在研究表面分子或近表面分子的取向、旋转和荧光寿命方面已取得很好的效果。 全内反射的基本理论[2][3] 全内反射 全内反射现象是生活中的一种常见现象，如钻石的色彩斑斓和光纤的光线传播等。如图1所示 ，当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中。入射光在两介质接触面一部分发生反射，一部分发生折射。入射角θ1和透射角θ2之间满足关系式 n1sin θ1=n2 sin θ2 （1） 若n1大于n2，由公式（1）可以看出当入射角增大时，透射角也增大。假设增大到临界角θc时的透射角为90°。当光线以大于或者等于临界角θc入射时，入射光在界面处只发生反射而不再透射进n2介质，也就是发生了全反射。由snell定律可知 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1) （2） 由上式可知，当n1大于n2时，全反射就可能发生。如果玻璃的折射率取为1.52，溶液的折射率取为1.33(生物细胞的折射率范围是1.33～1.38)，则玻璃/界面处的临界角为61.74°。即当光线从玻璃中射入溶液中时，入射角大于61.74°时就会发生全反射。 隐失波 从几何光学的角度来看,当发生全反射时,光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上,由于波动效应,有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中,平行于界面传播。这部分光就是所谓的隐失波。隐失波是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，在平行界面方向以平行波场方式传播而在垂直界面方向则是呈指数衰减。透射强度和浸透深度公式如公式（3）所示。由公式知，对于可见光波长而言，浸透深度为～100nm。 全内反射荧光显微镜 到目前，科学家们已经发展了多种全内反射荧光显微成像系统。其中最为普遍的两种类型是棱镜型和物镜型。（如图2所示）棱镜型成像系统的隐失场是通过入射光经棱镜发生全反射产生的，而物镜型的是通过入射光经物镜本身全反射产生。隐失波激发生物样品的荧光分子，荧光分子所发射的荧光经过物镜成像到照相机或CCD上实现对生物样品的记录。（如图3所示） 两种形式的显微镜各有优缺点，对于棱镜型而言，实现起来相对简单，同时它的缺点也很明显：由于要达到较高的光学分辨率，要求接收荧光的物镜工作距离较短，这样留给生物样品和物镜之间的空间较小，所以在此仪器上安装一些诸如原子力显微镜、近场光学显微镜等其他探测仪器非常困难。并且由于荧光的接收必须经过图2（a）所示的被观察样品的上部，这样荧光必然会有散射、衰减及其它光信号的干扰，使观察的效果有所下降。而对物镜式而言，则可以克服以上缺点。物镜式显微镜的物镜既作为收集样品荧光信号的接受器，同时又作为发生全反射的光学器件。如图2（b）所示，激光聚焦到物镜后焦面并经过物镜边缘入射，物镜出射光为平行光并斜入射至盖玻片上，调节激光入射位置和角度，即可达到全内反射要求，从而实现隐失波照明。隐失波所激发的荧光仍旧经过物镜接收，通过双色镜滤掉除荧光以外的其它波长的光，成像在物镜后方的照相机或CCD上，实现对生物样品的荧光记录。由于样品上方空间完全空出，并且所接受的荧光没有被样品干扰，所以目前大多数生物学家采用物镜式全内反射荧光显微镜。 在生物学上的应用 细胞内的很多至关重要的生命活动过程均存在于细胞表面,如果我们可以直接对这些细胞表面的过程进行观测,而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰,这对细胞生物学研究来说,将是具有重大意义的突破[5～7]。全内反射荧光显微镜的最大优势就是利用隐失波照明,它的荧光激发深度只在～100ｎｍ的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。 全内反射荧光法在生物中的应用主要体现在以下几方面:蛋白质吸附平衡、表面分子浓度梯度变化、表面分子的旋转、荧光寿命及反应速率的测量及选择性观测细胞/底物接触区等。其中蛋白质界面吸附平衡是全内反射荧光法的重点应用领域[8]。可通过研究蛋白质在人工表面的吸附平衡来了解各种生物材料的表面性质。Edmisten等[9]利用全内反射荧光各向异性和吸收二色性结合研究细胞膜中的分子旋转分布。Chan等[10]将全内反射荧光用于液-固界面的ＤＮＡ寡核苷酸的吸附和表面扩散研究。利用一种ｐＨ敏感荧光团产生的全内反射荧光,可观测吸附水解酶的自发重构化[11]。全内反射荧光技术用于实时监测核酸相互作用[12]、考察吸附在石英上的水解酶分子的重定向机制[13],以及观察细胞膜100ｎｍ范围内的实时生命活动[14]也都有报道。 展望 全内反射荧光显微术作为细胞表面单分子成像的一种新兴的技术，Derek Toomre[2]等认为它将向两个前沿方向发展，一方面是将继续与其它显微成像技术如荧光相关光谱技术(FCS),荧光寿命成像技术(FLIM)以及原子力显微术(AFM)相结合;另一方面是发展双色和多色TIR-FM，采用多种染色来观察活体细胞。这两个方面在近些年都有了很大发展，如Takafumi Yamada[15]等用AFM和TIR-FM结合观察到高灵敏度的蛋白分子，Shhei Nishida[16]等对单细胞进行纳米操作等。单波长光激发的双色荧光观察活细胞也有报道。[17，18]随着光电探测设备探测效率和探测速度的提高以及单分子染色技术的发展，我们有理由相信，全内反射荧光显微术将会更加清晰的将活体细胞膜表面的动态成像展现在我们面前。 参考文献 [1] Humming Nie, Richard N. 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