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激光共聚焦显微镜定位细胞荧光标记的工作原理
2020-12-28 | 来源：
激光共聚焦显微镜采用激光为激发光源，优点是得到高的分辨率，记录钙离子三维空间分布；双光子荧光显微镜则采用红外激光作为光源，具有高空间分辨率，而且噪声比较低。共聚焦显微镜可清晰地显示相对较厚的(厚达几百微米)标本内部结构图像，尤其适于检测荧光标本。使用传统的宽视场荧光显微镜时，由于标本全层的荧光团都被光照到，而且它不仅收集焦平面上的荧光信号，还收集焦平面上下方的荧光信号，所以用它来观察较厚荧光标本时，图
激光共聚焦显微镜采用激光为激发光源，优点是得到高的分辨率，记录钙离子三维空间分布；双光子荧光显微镜则采用红外激光作为光源，具有高空间分辨率，而且噪声比较低。共聚焦显微镜可清晰地显示相对较厚的(厚达几百微米)标本内部结构图像，尤其适于检测荧光标本。
使用传统的宽视场荧光显微镜时，由于标本全层的荧光团都被光照到，而且它不仅收集焦平面上的荧光信号，还收集焦平面上下方的荧光信号，所以用它来观察较厚荧光标本时，图像模糊且反差小。而激光共聚焦显微镜则选择性收集来自标本内部相当于单一焦平面的光切面(约lgm)的光线。
由于共聚焦显微镜基本没有来自离焦区的光线，所以它所观察的焦平面内结构要比传统显微镜清晰得多。一系列不同厚度的光切面可使标本的三维图像得以重建。在检测组织片或完整的小生物(如果蝇和斑马鱼的胚胎)中的荧光染色细胞时，可选用共聚焦显微镜。
共聚焦显微镜也可用来定位分离细胞内的荧光标记分子。由于其灵敏度较高，甚至可以用来监控活体标本内的荧光，使得示踪荧光探针如绿色荧光蛋白的利用成为可能。此外，有些型号的共聚焦显微镜加以调整后，可用于光漂白实验及光敏化“笼锁”分子(紫外光照射前为失活状态)。
激光共聚焦显微镜通过聚焦光束扫描标本及荧光信号的收集来实现光切，所收集的荧光信号为通过空间滤波器(-g-为针孔式)的所有光点，而空间滤波器是用来阻挡来自标本离焦区域的信号的。
激光共聚焦显微镜进行光切的结构基础。光源(常为激光器)均匀地照亮物镜后焦平面，并将光线聚焦在标本内的衍射极点上。尽管焦平面上下方也能被照到，不过焦点照射强度大。由入射光激发的荧光分子向各个方向发出荧光。物镜收集的荧光聚焦在像平面上，它与标本内的焦平面是共轭的(共焦的)。像平面内的针孔孔径允许标本内照明点发出的荧光通过并到达检测仪，但却阻止来自离焦区域的光线通过。
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