在使用时，我们需要先把目镜测微尺装入目镜筒中，具体操作为：先把目镜从显微镜上拔下来，在远离镜片（也就是我们平时观察时看的地方）的一端有个齿轮状的圆形结构，把它拧开，然后把目镜测微尺装入其中，注意正面要放于视场光阑上，然后将其拧回去，放回目镜就行了。有的的显微镜由于结构精密，不允许拆卸，需专门配有测微尺的目镜。然后将测微台尺放于载物台上，调节显微镜焦距知道能看到台尺清晰的刻度为止。这时调整让两尺子的一端在整刻度重合，然后寻找另一端在什么地方重合，数出他们重叠部分的格数就能算出目镜测微尺在放大情况下的实际倍率了。

        具体计算公式如下：

目镜测微尺每格=（台尺重叠数X10）÷目尺重叠格数。如上图台尺的重叠格数为4格，目镜测微尺的重叠格数为10格。由此可以计算出目镜测微尺每格代表的长度为：（4X10）/10=4um。

        确定好目镜测微尺每格代表的长度后移开台尺，之后使用时就能用它确定被检物实际长度了。由于生物显微镜有多个物镜，每个物镜放大倍率不同，目镜测微尺在不同倍率下所代表的实际长度不同，因此在切换倍率时应重新校准。