随着组织透明化技术和光片荧光显微技术的发展，3D荧光成像技术实现了快速获取3D组织信息的能力。光片显微镜由于其独特的3D成像能力以及更快的成像速度逐渐成为生命科学研究中3D荧光成像的强有力工具。光片显微镜的实现方式是将激发光片限制在探测焦平面内，使得激发光对样品的光漂白和光毒性降到最低，具有高的三维空间分辨率和良好的光学层析能力。

在光片显微镜中，光片越薄，光片层析能力越好，轴向分辨率越高；光片越厚，光学层析能力减弱，轴向分辨率变差。由于高斯光束的截面半径连线为双曲线，光片在沿着光传播的方向上无法一直保持厚度一致，光片较薄也就是轴向分辨率最好的一段被称为束腰。通常，我们以光片束腰的长度作为选择视野大小的依据。束腰的长度与光片的厚度是正相关的，要想获得更高的轴向分辨率，光片就需要更薄，束腰就会越短，相应的视场就越小；同理，想要获取更大的视场，光片就越厚，束腰更长，相应的光学层析能力减弱、轴向分辨率降低。那么如何制作一个薄且均匀的激发光片来覆盖大的FOV（Field of view），并尽可能将激发光限制在探测焦平面附近呢？

为寻求空间分辨率、光学层析能力和FOV之间的最佳平衡，最大限度地发挥光片荧光显微镜的3D成像能力，西湖大学高亮实验室提出了平铺光片技术的概念，旨在满足两个要求：首先，显微镜可以实现最新的选择性照明光片，以便在不同的应用中发挥其优势，并且可以快速调整光片以实时优化成像性能；其次，可以在检测图像平面内快速平铺光片以扩大视野且不影响空间分辨率和光学层析能力。基于平铺光片技术，高亮实验室与锘海生命科学共同研制了新型平铺光片照明显微镜LS18。

传统光片显微镜的成像方式是怎么样的？

光片显微镜对一个大的样品组织进行三维成像时需要将样本细分成多个ROI（Region of interest）成像。这种方式本质上是光片显微镜中空间分辨率和视场大小之间的折衷。

如图1所示，在较大的FOV下，采用一个较长的光片激发成像，该方式成像的特点在于它的成像速度快，采集图像的数据量小，且整个样品被划分的ROI较少，图像三维重构相对容易。然而，由于此时用的放大倍数较小，视野大的同时，光片也较厚，因此光片的层析能力也大幅度降低，成像结果不但在横向上的分辨率较低，其轴向上的分辨率也更低。

这时，研究者若想获取更高空间分辨率的3D成像数据，就需要使用更大的放大倍数并且采用更薄的光片。那么，成像的FOV缩小，样本成像细分的ROI将增多（如图2所示），导致样品在横向上的平移次数增加，此时采用的光片更薄，使得轴向上步进减小，样品成像的速度变慢。样品成像时间及采集数据大小会随着空间分辨率的增高而增加。此时图像重建工作量也将大幅度增大，主要原因有： 1. 采集数据大小明显增大；2. 需要在ROI之间做更多的图像拼合处理；3. 一些透明化方法处理的样品较软，且成像液的粘度较高，频繁移动可能使样品在成像过程中产生形变，给数据拼合增加困难。因此，样品在横向上的平移速度必须足够慢，以尽量减少3D重建的问题，这就进一步降低了样品成像速度。

 图2 高分辨率下，传统光片显微镜的成像方式

什么是平铺光片技术？

LS18是如何实现快速高分辨3D成像的？